Informație

Metilarea ADN-ului pe catena directă vs inversă?

Metilarea ADN-ului pe catena directă vs inversă?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Mă întreb dacă ar trebui să existe diferențe în metilarea ADN-ului între catena directă și cea inversă a genei? Mă întreb, deoarece în proiectarea grundului pentru pirozecvențierea bisulfitei s-ar putea proiecta grundurile doar pentru firul direct. Ar trebui să conteze acest lucru pentru ADN-ul uman / șoarece?

urale și mulțumiri anticipate pentru orice sfat.


În majoritatea țesuturilor, aproape 100% din metilarea ADN are loc la siturile CpG. Aceasta oferă un mecanism simplu pentru moștenirea epigenetică. Deoarece C și G sunt complementare, ambele catene au situsul CpG în același locus și metilarea este fie prezentă pe ambele catene, fie pe niciuna dintre ele. În timpul replicării, fiecare moleculă de ADN fiică moștenește un fir părinte cu situsurile CpG (ne) metilate. Enzimele pot recunoaște când există o metilare asimetrică a CpG și, ulterior, pot metila noua catenă acolo unde este necesar. Deci, pentru site-urile CpG, ambele catene sunt metilate sau nu.

Cu toate acestea, în celulele stem embrionare și induse, ~ 25% din metilarea totală are loc la site-uri non-CpG (în special CpA). Astfel, metilarea la un locus specific ar avea loc numai pe un fir. Din câte știu, cum/dacă acest model de metilare este moștenit nu a fost încă elucidat. În plus, acest tip de metilare are loc în întregul cromozom și este deosebit de mare în exoni, în timp ce metilarea CpG are loc în general în amonte de un situs de pornire a transcripției.


Există, de asemenea, un fenomen numit hemimetilare, în care unul dintre fire este metilat, în timp ce celălalt este nemetilat sau invers. Au existat diverse întrebări de cercetare asociate cu hemimetilarea, puteți găsi mai multe despre aceasta aici: http://nathansheffield.com/wordpress/what-is-hemimethylated-dna/


Metilarea ADN-ului pe catena directă vs inversă? - Biologie

Suportul clientului: La fel ca și componenta Sursă. Pentru conținutul personalizat, este firul trimis de client pentru proiectarea sondei.

ILMN Strand, alias Strand de proiectare: Suvita utilizată de Illumina pentru proiectarea sondelor pe baza stabilității termodinamice și a specificității locusului conform NCBI BLAST. Din acest motiv, poate diferi de segmentul Client/Sursă.

Secțiunea înainte/înapoi (înainte/înapoi): Folosite de dbSNP, desemnările Fwd/Rev se pot schimba cu actualizările NCBI Genome Build, astfel încât Genome Build trebuie specificată atunci când se raportează firele Fwd/Rev. 1. Pentru SNP-urile din produsele matrice standard, Fwd strand = Source strand și provine din dbSNP. 2. Pentru SNP-uri de produse cu matrice personalizate fără rsid, clientul poate identifica componenta Sursă ca Fwd sau Rev, pe baza propriilor criterii. Fișierele de produse personalizate Illumina utilizează denumirile Fwd / Rev ale clientului. Notă: Componenta Fwd, așa cum este identificată în fișierele de produse standard Illumina, nu trebuie confundată cu componenta Plus (+), pe care HapMap o numește interschimbabil „componenta înainte”.

Suvita Plus / Minus (+/-): Denumirea standard pentru toate organismele eucariote utilizate de HapMapand 1000 Genomes Project. Capătul 5 ′ al firului (+) este la vârful brațului scurt (brațul p) al cromozomului, iar capătul 5 ′ al firului (-) este la vârful brațului lung (brațul q). Denumirile (+/-) se pot modifica odată cu actualizările NCBI Genome Build, deci Genome Build trebuie să fie specificat la raportarea șirurilor (+/-).


Modelele de metilare ADN ale senescenței replicative sunt specifice catenelor și reflectă modificările conformației cromatinei

Senescența replicativă a celulelor din cultură este asociată cu modificările de metilare a ADN-ului (DNAm) foarte reproductibile la locurile specifice ale genomului. Până în prezent, este în mare măsură neclar dacă aceste modificări epigenetice sunt reglate direct sau dacă sunt evocate aleatoriu de alte modificări ale cromatinei în timpul culturii pe termen lung.

Am identificat dinucleotidele CG (CpG) care devin continuu hiper- sau hipo-metilate în cursul expansiunii culturii de celule stem mezenchimale (MSC) și alte tipuri de celule. Aceste modificări oferă un biomarker pentru senescența replicativă și se corelează cu numărul de pasaje in vitro. În timpul reprogramării în celule stem pluripotente induse (iPSC), ADNm asociat senescenței este inversat simultan cu modificările ADNm asociate pluripotenței. Secvențierea ampliconului cu cod de bare bisulfit (BBA-seq) a demonstrat că la trecerea modelelor ADNm ale CpG-urilor învecinate devin mai complexe fără dovezi ale dezvoltării continue a modelelor. În special, BBA-seq a moleculelor de ADN legate de ac de păr au demonstrat că multe diade CpG sunt metilate numai pe catena înainte sau inversă. Această hemimetilare a fost conservată în multe pasaje, ceea ce indică faptul că nu s-a datorat menținerii insuficiente a modelelor DNAm. Captarea conformației cromatinei circularizate (4C) a CpG-urilor asociate senescenței a dezvăluit modificări reproductibile în timpul senescenței fără dovezi pentru interacțiunea preferențială între CpG-uri care devin fie hiper- sau hipometilate.

Luate împreună, DNAm asociat senescenței fluctuează stocastic la anumite locuri din genom. ADNm specific catenelor și modificările reproductibile în 4C indică faptul că modificările epigenetice ale acestor diade CG nu sunt reglementate într-o manieră țintită, ci mai degrabă cauzate de stări de conformare a cromatinei de ordin superior, specifice pasajului.


Cum putem măsura vârsta biologică

Pentru a înțelege modalitățile prin care putem măsura vârsta biologică și pentru a conecta punctele dintre îmbătrânirea biologică și metilarea ADN-ului - care, după cum sugerează și numele, este adăugarea și îndepărtarea grupărilor metil din catenele de ADN - trebuie să ne dăm înapoi și să ne uităm la unele dintre ele. salturile științifice gigantice făcute în ultimele două decenii. Unul dintre cele mai interesante a fost înțelegerea din ce în ce mai mare a noastră epigenetica.

Epigenetica este stratul biochimic descris ca așezat deasupra ADN-ului nostru, care reglează modul în care este citit materialul genetic. În funcție de tiparele epigenetice ale unei anumite gene, acea genă poate fi „activată” (adică, citită și utilizată în mod activ) sau „oprită” (adică închisă și tăcută). Genele pe care ați putea dori să le activați sunt acelea precum genele supresoare tumorale, care luptă împotriva cancerului, iar cele pe care ați putea dori să le opriți sau cel puțin să le reduceți sunt cele care promovează inflamația. Cu toate acestea, acesta este exact opusul a ceea ce se întâmplă cu aceste gene pe măsură ce vârsta noastră biologică crește. Este aproape ca și cum am fi programați pentru boală. Cu excepția cazului în care putem găsi o modalitate de a încetini sau inversa procesul de îmbătrânire în sine.

De departe cel mai proeminent și cel mai bine cercetat mecanism epigenetic biochimic este metilarea ADN-ului, care implică adăugarea unei mici „grupări metil” (pur și simplu un carbon cu trei hidrogeni atașați) la o bază de citozină expusă pe firul ADN.

Metilarea ADN-ului este cel mai bine studiat mecanism epigenetic și este profund legată de îmbătrânirea biologică.

Recent, s-a demonstrat că modelele de metilare a ADN-ului prezic vârsta biologică cu o acuratețe incredibilă. Cu doar câțiva ani în urmă, în 2013, Dr. Steve Horvath, unul dintre cei mai importanți cercetători epigenetici, a publicat o lucrare extrem de interesantă. În cadrul acestuia, el a prezentat munca pe care el și echipa sa de la UCLA au făcut-o pentru a prezice vârsta umană prin măsurarea stării de metilare a 353 de situri de citozină pe ADN-ul nostru și a o face semnificativ mai mult decât lungimea telomerilor și biomarkerii metabolici.

Alți oameni de știință au început, de asemenea, să-și publice propriile predictori de vârstă epigenetică și, în mod colectiv, aceștia au devenit cunoscuți ca „ceasuri epigenetice” sau „ceasuri biologice”. Sunt cea mai bună metodă pe care o avem pentru a determina vârsta biologică.

Și ne pot ajuta, de asemenea, să evaluăm modul în care intervențiile noastre de sănătate ne afectează îmbătrânirea.

Alăturați-vă Younger Youniverse pentru a preveni și inversa îmbătrânirea biologică și intrați pe lista de așteptare pentru programul nostru Younger You.


Concluzii

Alopoliploizii pot folosi diverse mecanisme pentru a face față genomului duplicat și redundant. În timp ce studiile anterioare ale Tragopogon alopoliploizii au arătat că pierderea homeologului este o consecință obișnuită a alopoyploidizării, aici arătăm că metilarea ADN poate reduce la tăcere un homeolog progenitor sau poate regla nivelul de exprimare a celor doi homeologi progenitori. Ca resurse genomice suplimentare pentru Tragopogon sunt dezvoltate, ar trebui efectuate analize de metilare la nivelul genomului pentru a evalua cât de extinsă este metilarea homeologă în cadrul speciilor alopoliploide.


Informatia autorului

Adresa actuală: Departamentul de Inginerie Biomedică, Universitatea din California-Irvine, Irvine, CA, SUA

Acești autori au contribuit în mod egal: Jocelyn Charlton și Timothy L. Downing.

Afilieri

Departamentul de Reglare a Genomului, Institutul Max Planck pentru Genetică Moleculară, Berlin, Germania

Jocelyn Charlton, Sven Klages, Bernd Timmermann și amplificatorul Alexander Meissner

Departamentul de Celule Stem și Biologie Regenerativă, Universitatea Harvard, Cambridge, MA, SUA

Jocelyn Charlton, Timothy L. Downing, Zachary D. Smith, Kendell Clement, Ramona Pop, Veronika Akopian, Alexander M. Tsankov și Alexander Meissner

Broad Institute of MIT și Harvard, Cambridge, MA, SUA

Timothy L. Downing, Zachary D. Smith, Hongcang Gu, Kendell Clement, Alexander M. Tsankov, Andreas Gnirke și amplificatorul Alexander Meissner

Ken & amp Ruth Davee Departamentul de Neurologie, Departamentul de Fiziologie, Școala de Medicină Feinberg, Universitatea Northwestern, Chicago, IL, SUA

David P. Santos & Evangelos Kiskinis

Departamentul de Psihiatrie Translațională, Institutul de Psihiatrie Max Planck, München, Germania

Puteți căuta acest autor și în PubMed Google Scholar

Puteți căuta acest autor și în PubMed Google Scholar

Puteți căuta acest autor și în PubMed Google Scholar

Puteți căuta acest autor și în PubMed Google Scholar

Puteți căuta acest autor și în PubMed Google Scholar

Puteți căuta acest autor și în PubMed Google Scholar

Puteți căuta acest autor și în PubMed Google Scholar

Puteți căuta acest autor și în PubMed Google Scholar

Puteți căuta acest autor și în PubMed Google Scholar

Puteți căuta acest autor și în PubMed Google Scholar

Puteți căuta acest autor și în PubMed Google Scholar

Puteți căuta acest autor și în PubMed Google Scholar

Puteți căuta acest autor și în PubMed Google Scholar

Puteți căuta acest autor și în PubMed Google Scholar

Puteți căuta acest autor și în PubMed Google Scholar

Contribuții

J.C., T.L.D. și A.M. a proiectat studiul cu contribuția de la Z.D.S. T.L.D., J.C., R.P. și V.A. a efectuat experimentele. H.G. și A.G. au dezvoltat protocolul RRBS cu o singură celulă multiplexată, au generat bibliotecile de secvențiere și au ajutat la proiectarea și analiza experimentală. K.C., S.K., B.T. și M.J.Z. asistat în prelucrarea datelor. J.C. a efectuat analize bioinformatice. A.M.T. a efectuat analiza ciclului celular ARN-seq unicelular. D.P.S. și E.K. a efectuat diferențierea, caracterizarea și colectarea probelor MN. J.C., T.L.D., Z.D.S., A.G. și A.M. a interpretat datele. J.C., T.L.D., Z.D.S. și A.M. a scris manuscrisul cu ajutorul celorlalți autori.

Autorul corespunzator


Figura suplimentară 1 Izolarea și analiza globală de metilare a nucleelor ​​neuronale (NeuN + ) și non-neuronale (NeuN - ) din țesuturile creierului înghețate.

(A) Nucleii din acest exemplu reprezentativ au fost izolați prin sortarea nucleelor ​​activate cu fluorescență (FANS) din cortexul prefrontal (BA9) și resturile, dubletele și nucleele auto-fluorescente au fost închise. Nucleii rămași au fost separați pe baza detectării anticorpului anti-NeuN conjugat cu AlexaFluor 488. FANS-urile au fost repetate de cel puțin 8 ori pe regiune a creierului. (b) Exemplu de nuclee colorate cu anti-NeuN și DAPI, atât înainte, cât și post-sortare, repetate de două ori cu rezultate similare. (c) Proporția de nuclei NeuN + izolați prin FANS din probe de țesut din regiunile cerebrale indicate, săgețile indică două perforații din aceeași probă de țesut. Țesuturile provin din BA9, cortex cingulat anterior (BA24), hipocamp (HC) și nucleu accumbens (NAcc) de la șase indivizi, după cum sa indicat. (d) Proporția de nuclei NeuN + izolați prin FANS reprezentați grafic în funcție de intervalul post-mortem din probe de țesut din regiunile cerebrale indicate (BA9, n = 11 BA24, n = 13 HC, n = 13 NAcc, n = 8 indivizi). Suprapusă este o linie care arată media condiționată și intervalul de încredere de 95% umbrit, pentru această relație estimată folosind un model liniar în fiecare țesut. (e) CpG autosomal mediu (mCG) și (f) metilarea non-CpG (mCH) a NeuN + (n = 6 persoane pentru BA9, HC, NAcc și n = 5 pentru BA24) și NeuN − nuclee (n = 6 persoane pentru BA9, HC, NAcc și n = 4 pentru BA24) sunt indicate diferențe semnificative în mC global între țesuturi în contexte de dinucleotide și starea NeuN. Valori P în (e,f) sunt ajustate pentru comparații multiple utilizând testul diferenței semnificative oneste de la Tukey.

Figura suplimentară 2 Diferențele în metilarea ADN-ului dintre regiunile creierului sunt limitate la nucleele neuronale.

Analizele componentelor principale (PCA) ale distanțelor derivate din nivelurile medii de metilare CpG autozomale în intervale de 1 kb în (A) țesuturi în vrac, (b) Nuclei NeuN +, (c) țesuturi în vrac și nuclee sortate combinate și (d) NeuN − nuclee. Țesuturile, tipul de eșantion și indivizii sunt indicați așa cum se arată. (e) Matricea de corelație între eșantioane pe baza metilării medii a CpG-urilor partajate între toate eșantioanele. (a-e) Țesuturile provin din cortexul cingulat anterior (BA24 NeuN + n = 5 indivizi NeuN - n = 4, în vrac n = 6), cortexul prefrontal dorsolateral (BA9 NeuN + n = 6, NeuN - n = 6, vrac n = 6), hipocamp (HC NeuN + n = 6, NeuN - n = 6, vrac n = 6) și nucleul accumbens (NAcc NeuN + n = 6, NeuN - n = 6, vrac n = 6).

Figura suplimentară 3 Analiza variabilității între tipurile de eșantioane.

(A) Corelații Pearson pentru metilarea ADN între probele din același țesut fie în cadrul unui donator (probe în vrac compuse atât din NeuN +, cât și din NeuN - n = 27) sau un tip de celulă (NeuN +, n = 23 sau NeuN -, n = 22 probe). (b) Între variația eșantionului într-o regiune a creierului și tipul eșantionului, în funcție de nivelul de metilare. (c) Proporția CpGs cu o diferență absolută estimată de metilare mai mare de 10% (aleasă deoarece CG-DMRs au toate o diferență absolută de metilare & gt 10%) între regiunile cerebrale indicate, stratificate în funcție de tipul eșantionului (NeuN +, NeuN -, în vrac).

Figura suplimentară 4 Profilurile de metilare sunt distincte între nucleele neuronale și non-neuronale și între neuronii din regiuni distincte ale creierului.

(A) Gruparea ierarhică a probelor pe baza metilării medii pe probă a primelor 20.000 CG-DMR specifice tipului de celulă. Exemple de (b) CG-DMR-uri specifice tipului de celulă și un bloc specific de tip celular de metilare diferențială (NeuN + este verde NeuN - este purpuriu) și (c) CG-DMR neuronale. Valorile de metilare sunt afișate cu CG-DMR umbrite în roz și se suprapun cu genele care codifică proteinele prezentate sub fiecare grafic. (d) Valorile medii de metilare CpG pentru nucleele NeuN + din fiecare regiune a creierului pe o fereastră de 3 kb centrată pe CG-DMR (n = 208) identificate printre BA9, BA24 și HC. Pentru BA9 și HC, n = 6 indivizi și n = 5 persoane pentru BA24. CG-DMR-urile au fost grupate prin gruparea k-means pe baza modelelor lor de metilare. Graficele de metagen pentru fiecare grup sunt prezentate în dreapta cu numărul de CG-DMR indicat. (e) Ca în (c) cu acoperire normalizată a secvențierii ATAC pentru nucleele NeuN + de la NAcc și BA9 (mijloacele individuale sunt linii transparente mijloacele tisulare sunt linii opace). Regiunile de accesibilitate diferențială (DAR), CG-DMR și blocurile CG sunt umbrite roz.

Figura suplimentară 5 Metilarea non-CpG este similară în toate catenele și contextele.

Metilarea neuronală (NeuN + ) non-CpG a fost măsurată în containere de 1 kb (n = 2.881.044) în autozomi. Coșurile cu puțină sau deloc acoperire a citozinelor au fost îndepărtate. (A) Metilarea non-CpG în contextul CA pe catena pozitivă, comparativ cu două replici biologice. (b) Metilarea non-CpG în contextul CA comparată între catena pozitivă și cea negativă într-un eșantion individual. (c) Metilarea non-CpG pe catena pozitivă în comparație între contextul CA și contextul CT dintr-o probă individuală. Linia roșie continuă este y = x, linia roșie punctată este cea mai bună linie de regresie prin origine (corelația și ecuația prezentate pe grafic).

Figura suplimentară 6 Metilarea non-CpG este consecventă în întreaga catena și context și cu metilarea CpG.

Gruparea ierarhică a probelor pe baza scorului z al metilării peste (A) CA (-) DMR-uri, (b) CT (+) DMR-uri și (c) CT(-) DMR. (d) Gruparea ierarhică a probelor bazată pe scorurile z de metilare pentru CA(+) DMR care se suprapun CG-DMR.

Figura suplimentară 7 Regiunile deschise de cromatină disting clar eșantioanele NeuN + de NeuN -.

(A) Eșantionul de matrice de corelație a numărului de citiri ATAC-seq [log2(număr pe milion)] în regiunile deschise de cromatină (verde = nuclei NeuN +, violet = NeuN - nuclei, portocaliu = nucleu accumbens (NAcc), albastru = cortex prefrontal (BA9)). Pentru NeuN + și NeuN - eșantioane din BA9 și NAcc, n = 6 indivizi fiecare. (b) Graficul diferențelor medii a datelor de accesibilitate de vârf comparând: NeuN + cu NeuN − nuclee. Regiunile cu acces diferențial (DAR) sunt afișate în portocaliu. Datele au fost eșantionate aleatoriu (100% din DAR, 10% din non-DAR).

Figura 8 suplimentară Metilarea ADN și accesibilitatea cromatinei sunt corelate cu expresia genei.

(A) Nivelurile medii de metilare în jurul genelor care codifică proteine ​​(n = 19823) cu niveluri diferite de expresie în nucleele neuronale izolate din nucleul accumbens (NAcc) și cortexul prefrontal (BA9). Fiecare lungime genică este împărțită în 100 de coșuri și datele se extind pe două lungimi în sus și în aval. Expresia genei este împărțită în quartile pe baza RPKM. (b, c) Diagrame de dispersie care arată corelația Pearson a expresiei diferențiale a genelor [log2(schimbare ori)] (n = 16.538) cu: (b) mCA și mCG diferențiale și (c) accesibilitate diferențială [log2(schimbare de ori)] din nucleele neuronale NAcc vs BA9. Genele de codificare a proteinelor exprimate diferențial (DEG) sunt prezentate în portocaliu. Valorile de corelație (cu IC 95%) sunt date sub fiecare grafic. (d,e) Diagrame de dispersie care arată corelațiile Pearson ale expresiei diferențiale ale genelor [log2(schimbare ori)] cu caracteristici epigenetice diferențiale din nucleii neuronali NAcc vs BA9 care se suprapun (d) promotori și (e) corpuri de gene. DEG-urile sunt afișate în portocaliu și este indicat numărul de gene (n) cu o caracteristică(e). (f) Relațiile dintre expresia genelor care codifică proteinele și accesibilitatea cromatinei, mCA și mCG în corpul genei în nucleii neuronali NAcc și BA9. Contururile arată densitățile punctelor, linia roșie arată tendința netezită. (A-f) n = 6 indivizi pentru ambele probe neuronale NAcc și BA9.

Figura suplimentară 9 Analiza SLDSR a fiecărei caracteristici.

Fiecare caracteristică descrisă în figură a fost inclusă separat într-o analiză SLDSR, incluzând 53 de caracteristici de bază. Rezultatele din diferențialele noastre și cele 3 caracteristici epigenomice nediferențiale (Brain H3K27ac 30, CNS 51, chromHMM 15) sunt prezentate prin trăsătură, aceleași rezultate sunt afișate în Fig. 5 fără capacitatea de a identifica trăsături individuale. (A) Coeficientul scorurilor z. Îmbogățirea este raportată numai pentru trăsături în care cel puțin o caracteristică are un scor z semnificativ mai mare de 0 (testul z unilateral cu alfa = 0,05, valorile P corectate în cadrul fiecărei trăsături folosind metoda Holm). (b) Îmbogățire + / - 2 erori standard. Dimensiunile GWAS pentru fiecare trăsătură sunt raportate în tabelul suplimentar 24.

Figura suplimentară 10 Analiza SLDSR a caracteristicilor epigenomice diferențiale, controlând caracteristicile epigenomice nediferențiale.

Fiecare dintre caracteristicile epigenomice diferențiale (CG-DMR neuronale, DAR și CG-DMR și DAR de tip celular) a fost inclusă separat într-o analiză SLDSR cu cele 3 caracteristici epigenomice nediferențiale (Brain H3K27ac 30 , CNS 51 , chromHMM 15 ) incluse în linia de bază (53 de caracteristici). Rezultatele sunt prezentate prin trăsătură, aceleași rezultate sunt afișate în Fig. 5 fără capacitatea de a identifica trăsături individuale. (A) Coeficientul scorurilor z. Îmbogățirea este raportată numai pentru trăsături în care cel puțin o caracteristică are un scor z semnificativ mai mare de 0 (testul z unilateral cu alfa = 0,05, valorile P corectate în cadrul fiecărei trăsături folosind metoda Holm). (b) Îmbogățire + /− 2 erori standard. Dimensiunile GWAS pentru fiecare trăsătură sunt raportate în tabelul suplimentar 24.

Figura suplimentară 11 Analiza SLDSR a caracteristicilor epigenomice diferențiale, controlând caracteristicile epigenomice nediferențiale prin excluderea suprapunerii acestora față de valoarea inițială.

Fiecare dintre caracteristicile epigenomice diferențiale (CG-DMR neuronale, DAR și CG-DMR și DAR de tip celular) a fost inclusă separat într-o analiză SLDSR, inclusiv cele 3 caracteristici epigenomice nediferențiale (Brain H3K27ac 30 , CNS 51 , chromHMM 15 ) în linia de bază. Pentru cele 3 caracteristici epigenomice nediferențiale incluse în linia de bază, am eliminat orice suprapunere cu caracteristicile epigenomice diferențiale. Rezultatele sunt afișate pe trăsături, aceleași rezultate sunt afișate în Fig. 5 fără capacitatea de a identifica trăsăturile individuale. (A) Coeficientul scorurilor z. Îmbogățirea este raportată numai pentru trăsături în care cel puțin o caracteristică are un scor z semnificativ mai mare de 0 (testul z unilateral cu alfa = 0,05, valorile P corectate în cadrul fiecărei trăsături folosind metoda Holm). (b) Îmbogățire + /− 2 erori standard. Dimensiunile GWAS pentru fiecare trăsătură sunt raportate în Tabelul suplimentar 24.


Abrevieri

5mC5-metilcitozină
5hmC5-hidroximetilcitozină
AuNPsNanoparticulă de aur
bppereche de baze
CGIInsula CpG
CTPragul ciclului
COBRAAnaliza combinată a restricției de bisulfit
DNMTADN metiltransferază
ELISATest legat de imuno absorbția enzimelor
CEElectrochimic
HRCAAmplificare cu rotire hiperbranșată
HPLCCromatografie lichidă de înaltă performanță
HPVPapilomavirus uman
HRPPeroxidaza de hrean
IVDdiagnostic in vitro
LUMATest de metilare luminometrică
LODLimita de detectare
MBDDomeniul de legare la metil-CpG
MS-PCRPCR specifică pentru metilare
MS-HRMTopire de înaltă rezoluție specifică metilării
MSREEnzime de restricție sensibile la metilare
MeDIPImunoprecipitare ADN metilat
MIRATestul de recuperare a insulei CpG metilat
MS-SnuPEExtensie primer cu o singură nucleotidă sensibilă la metilare
MS-MLPAAmplificare sondă dependentă de ligare multiplex sensibilă la metilare
MALDI-TOFTimp de zbor de desorbție/ionizare cu laser asistat de matrice
MS-MRMMonitorizarea reacțiilor multiple prin spectrometrie de masă
NGSSecvențierea generației următoare
NSCLCCarcinom pulmonar cu celule mici
ntnucleotidă
ODDensitate optica
REEnzima de restricție
RRBSSecvențierea cu bisulfit de reprezentare redusă
SNPPolimorfism cu o singură nucleotidă
SMRTSecvențierea în timp real a unei singure molecule
WGBSSecvențierea întregului genom bisulfit

Grunduri de bisulfit- & # 34 Top & # 34 și & # 34 Bottom & # 34 Strand - (17 septembrie 2012)

Bună ziua, sunt în căutarea unui ajutor în ceea ce privește proiectarea primerilor de secvențiere a bisulfitului.

Pe măsură ce revizuiesc literatura de specialitate, am văzut că unele lucrări se referă la seturi de grund proiectate în mod specific fie pentru firul inferior, fie pentru partea superioară. Acest lucru poate avea o explicație simplă pe care mi-o lipsește, dar totuși îmi este greu să înțeleg acest lucru. Când proiectăm grundele pentru PCR normal, alegem un grund din firul superior și un primer din firul invers. Cum am alege primeri dintr-un singur fir dacă secvențele sunt aceleași, dar doar complementul invers unul al celuilalt? Apreciez orice perspectivă pe care o puteți oferi!

Ai putea, te rog, să citezi la ce lucrări te referi?

După modificarea bisulfitului, două catene de ADN nu mai sunt complementare. Când proiectăm primeri PCR de bisulfit, de obicei îi proiectăm pe catena de ADN sens, deși nu este greșit să proiectăm primerii pe catena minus. Acest lucru se bazează pe faptul că metilarea ADN-ului este simetrică. Sper că m-am făcut înțeles.

Deoarece cele două catene de ADN nu mai sunt complementare după modificarea bisulfitului, primerii specifici catenei sunt utilizați pentru amplificarea PCR. De obicei, firul de sens este ales pentru proiectarea primerului.

Vă mulțumesc foarte mult pentru toate răspunsurile dvs. Lucrarea pe care o privesc în mod specific este:

Hansen, R. S. „Metilarea X specifică de inactivare a elementelor LINE-1 de către DNMT3B: Implicații pentru ipoteza de repetare Lyon”. Genetica moleculară umană 12.19 (2003): 2559-567.

Iată un alt începător confuz. Încă nu sunt 100% sigur că înțeleg discuțiile despre primerii „specifici firului”. Nu este acest lucru la fel ca proiectarea primerului PCR „tradițional”, cu excepția faptului că unul, desigur, folosește o secvență transformată în bisulfat?

Vreau să spun, de obicei folosesc doar secvența firelor de sens ca șablon de design și folosesc ceva de genul Primer3 pentru a alege primerii. Dacă acum folosesc secvența sens convertită în bisulfat, voi obține în mod evident un primer invers (antisens) care este complet complementar cu catena de sens și un primer direct (sens) care NU este complementar cu catena antisens din cauza conversiei bisulfatului. . Deci, în timpul primei runde a PCR, numai firul de sens va fi amplificat. Și după aceea, grundul înainte se va lega de noile produse, iar restul este amplificarea exponențială a firului de sens original. Acesta este ceea ce înseamnă specificitatea firului?

Pur și simplu nu văd ce altceva aș putea face. Adică, dacă aș proiecta primerii care se potrivesc ambelor fire convertite, ar amplifica șabloanele originale, dar nu și produsele, astfel încât amplificarea ar fi doar liniară.


Un comutator pornit-oprit pentru editarea genelor

În ultimul deceniu, sistemul de editare a genei CRISPR-Cas9 a revoluționat ingineria genetică, permițând oamenilor de știință să facă modificări specifice ADN-ului organismelor. În timp ce sistemul ar putea fi util în tratarea unei varietăți de boli, editarea CRISPR-Cas9 implică tăierea firelor de ADN, ducând la modificări permanente ale materialului genetic al celulei.

Acum, într-o lucrare publicată online în Celula pe 9 aprilie, cercetătorii au descris o nouă tehnologie de editare a genei numită CRISPRoff, care permite cercetătorilor să controleze expresia genică cu specificitate ridicată lăsând neschimbată secvența ADN-ului. Proiectată de Jonathan Weissman, membru al Institutului Whitehead, de la Universitatea din California San Francisco, profesor asistent Luke Gilbert, laboratorul Weissman postdoc James Nuñez și de colaboratori, metoda este suficient de stabilă pentru a fi moștenită prin sute de diviziuni celulare și, de asemenea, este complet reversibilă.

„Marea poveste aici este că avem acum un instrument simplu care poate reduce la tăcere marea majoritate a genelor”, spune Weissman, care este, de asemenea, profesor de biologie la MIT și investigator la Institutul Medical Howard Hughes. „Putem face acest lucru pentru mai multe gene în același timp, fără nicio deteriorare a ADN-ului, cu o mare omogenitate și într-un mod care poate fi inversat. Este un instrument excelent pentru controlul expresiei genelor.”

Proiectul a fost parțial finanțat printr-o subvenție din 2017 oferită de Agenția pentru proiecte de cercetare avansată în domeniul apărării pentru a crea un editor de gene reversibil. „Avansați cu patru ani [de la grantul inițial], iar CRISPRoff funcționează în cele din urmă așa cum sa imaginat într-un mod științifico-fantastic”, spune coautorul principal Gilbert. „Este incitant să văd că funcționează atât de bine în practică.”

Inginerie genetică 2.0

Sistemul clasic CRISPR-Cas9 folosește o proteină de tăiere a ADN numită Cas9 găsită în sistemele imune bacteriene. Sistemul poate fi direcționat către gene specifice din celulele umane folosind un singur ARN ghid, unde proteinele Cas9 creează mici pauze în catena ADN. Apoi, mașinile de reparații existente ale celulei acoperă găurile.

Deoarece aceste metode modifică secvența de ADN subiacentă, ele sunt permanente. În plus, dependența lor de mecanismele de reparații celulare „interne” înseamnă că este dificil să se limiteze rezultatul la o singură schimbare dorită. „Oricât de frumos este CRISPR-Cas9, preia repararea proceselor celulare naturale, care sunt complexe și cu mai multe fațete”, spune Weissman. „Este foarte greu să controlezi rezultatele.”

Aici cercetătorii au văzut o oportunitate pentru un alt tip de editor de gene - unul care nu a modificat ele însele secvențele ADN, ci a schimbat modul în care au fost citite în celulă.

Acest tip de modificare este ceea ce oamenii de știință numesc „epigenetici” - genele pot fi reduse la tăcere sau activate pe baza unor modificări chimice ale firului ADN. Problemele cu epigenetica unei celule sunt responsabile de multe boli umane, cum ar fi sindromul X fragil și diferite tipuri de cancer, și pot fi transmise de-a lungul generațiilor.

Silențierea genelor epigenetice funcționează adesea prin metilare - adăugarea de etichete chimice în anumite locuri din catena ADN - ceea ce face ca ADN-ul să devină inaccesibil ARN polimerazei, enzima care citește informațiile genetice din secvența ADN în transcripții ARN mesager, poate fi în cele din urmă planurile pentru proteine.

Weissman și colaboratorii au creat anterior alți doi editori epigenetici numiți CRISPRi și CRISPRa - dar ambii au venit cu o avertizare. Pentru ca acestea să funcționeze în celule, celulele trebuiau să exprime continuu proteine ​​artificiale pentru a menține modificările.

„Cu această nouă tehnologie CRISPRoff, puteți [exprima pe scurt o proteină] pentru a scrie un program care este amintit și desfășurat pe termen nelimitat de celulă”, spune Gilbert. „Se schimbă jocul, așa că acum scrii, practic, o schimbare care este transmisă prin diviziunile celulare – într-un fel putem învăța să creăm o versiune 2.0 a CRISPR-Cas9 care este mai sigură și la fel de eficientă și poate face toate acestea. și alte lucruri.”

Construirea comutatorului

Pentru a construi un editor epigenetic care ar putea imita metilarea naturală a ADN-ului, cercetătorii au creat o mașină mică de proteine ​​care, ghidată de ARN-uri mici, poate lipi grupurile de metil pe anumite pete de pe fir. Aceste gene metilate sunt apoi „tăcere” sau oprite, de unde și numele CRISPRoff.

Deoarece metoda nu modifică secvența catenei ADN, cercetătorii pot inversa efectul de reducere a zgomotului folosind enzime care îndepărtează grupările metil, o metodă numită CRISPRon.

Pe măsură ce au testat CRISPRoff în diferite condiții, cercetătorii au descoperit câteva caracteristici interesante ale noului sistem. În primul rând, ei ar putea viza metoda către marea majoritate a genelor din genomul uman - și a funcționat nu doar pentru genele în sine, ci și pentru alte regiuni ale ADN-ului care controlează expresia genelor, dar nu codifică proteine. „A fost un șoc imens chiar și pentru noi, pentru că ne-am gândit că va fi aplicabil doar pentru un subset de gene”, spune primul autor Nuñez.

De asemenea, în mod surprinzător pentru cercetători, CRISPRoff a reușit chiar să reducă la tăcere genele care nu aveau regiuni mari metilate numite insule CpG, care au fost considerate anterior necesare oricărui mecanism de metilare a ADN-ului.

„Ceea ce s-a crezut înainte de această lucrare a fost că 30 la sută din genele care nu au o insulă CpG nu au fost controlate prin metilarea ADN”, spune Gilbert. „Dar munca noastră arată clar că nu aveți nevoie de o insulă CpG pentru a dezactiva genele prin metilare. Asta, pentru mine, a fost o surpriză majoră.”

CRISPRoff în cercetare și terapie

Pentru a investiga potențialul CRISPRoff pentru aplicații practice, oamenii de știință au testat metoda în celulele stem pluripotente induse. Acestea sunt celule care se pot transforma în nenumărate tipuri de celule în organism, în funcție de cocktailul de molecule la care sunt expuse și, prin urmare, sunt modele puternice pentru studiul dezvoltării și funcției anumitor tipuri de celule.

Cercetătorii au ales o genă pentru a reduce la tăcere celulele stem și apoi le-au indus să se transforme în celule nervoase numite neuroni. Când au căutat aceeași genă în neuroni, au descoperit că aceasta a rămas redusă la tăcere în 90 la sută din celule, dezvăluind că celulele păstrează o memorie a modificărilor epigenetice făcute de sistemul CRISPRoff chiar dacă schimbă tipul celulei.

Ei au selectat, de asemenea, o genă pe care să o folosească ca exemplu despre modul în care CRISPRoff ar putea fi aplicat în terapie: gena care codifică proteina Tau, care este implicată în boala Alzheimer. După testarea metodei pe neuroni, au reușit să demonstreze că utilizarea CRISPRoff ar putea fi utilizată pentru a reduce expresia Tau, deși nu este complet dezactivată. „Ceea ce am arătat este că aceasta este o strategie viabilă pentru a reduce la tăcere Tau și a preveni exprimarea acelei proteine”, spune Weissman. „Întrebarea este, deci, cum le oferiți acest lucru unui adult? Și ar fi într-adevăr suficient să ai impact asupra Alzheimerului? Acestea sunt mari întrebări deschise, în special cele din urmă. ”

Chiar dacă CRISPRoff nu duce la terapii cu Alzheimer, există multe alte afecțiuni la care s-ar putea aplica. Și, deși livrarea către țesuturi specifice rămâne o provocare pentru tehnologiile de editare genică, cum ar fi CRISPRoff, „am arătat că o puteți livra tranzitoriu ca ADN sau ca ARN, aceeași tehnologie care sta la baza vaccinului Moderna și BioNTech pentru coronavirus”, Weissman spune.

Weissman, Gilbert și colaboratorii sunt entuziasmați de potențialul CRISPRoff și pentru cercetare. „Deoarece acum putem să reducem la tăcere orice parte a genomului pe care o dorim, este un instrument excelent pentru a explora funcția genomului”, spune Weissman.

În plus, a avea un sistem fiabil pentru a modifica epigenetica unei celule ar putea ajuta cercetătorii să învețe mecanismele prin care modificările epigenetice sunt transmise prin diviziunile celulare. „Cred că instrumentul nostru ne permite cu adevărat să începem să studiem mecanismul eredității, în special ereditatea epigenetică, care este o întrebare uriașă în științele biomedicale”, spune Nuñez.


Priveste filmarea: Vídeo 4 Metilação de DNA (Februarie 2023).