Informație

13.2: Genele și cromatina la eucariote - Biologie


Cromozomii și cromatina sunt o asociere unic eucariotă a ADN-ului cu mai multe sau mai puține proteine. ADN-ul bacterian (și ADN-ul procariot în general) este relativ „gol” - nu este vizibil asociat cu proteina.

Micrografia electronică a unui interfază celula (de mai jos) relevă faptul că cromatina poate exista ea însăși în diferite stări de condensare.

Cromatina este condensată maxim în timpul mitozei, formând cromozomi. În timpul interfazei, cromatina există în forme mai mult sau mai puțin condensate, numite Heterocromatina și euchromatin respectiv. Tranziția între aceste forme de cromatină implică modificări în cantitățile și tipurile de proteine ​​legate de cromatină și poate avea loc în timpul reglării genelor, adică atunci când genele sunt activate sau dezactivate. Genele active tind să fie în eucromatina mai dispersată, astfel încât enzimele de replicare și transcripție au acces mai ușor la ADN. Genele care sunt inactive în transcripție sunt heterocromatice, ascunse de proteinele suplimentare de cromatină prezente în heterocromatină. Ne vom uita la câteva experimente care demonstrează acest lucru într-un capitol ulterior.

Putem defini trei niveluri de organizare a cromatinei în termeni generali:

1. Se formează ADN înfășurat în jurul proteinelor histonice nucleozomi într-o structură „mărgele pe sfoară”.

2. Mulți nucleozomi se înfășoară (se condensează), formând structuri de fibre (solenoide) de 30 nm.

3. Împachetarea de ordin superior a fibrei de 30 nm duce la formarea cromozomilor metafazici observați în mitoză și meioză.

Nivelurile structurii cromatinei au fost determinate parțial prin izolarea selectivă și extracția cromatinei celulare interfazice, urmată de extracția chimică selectivă a componentelor cromatinei. Pașii sunt:

· Nucleii sunt mai întâi izolați din celule.

· Anvelopa nucleară s-a rupt ușor pentru a nu perturba fizic structura cromatinei.

· Cromatina poate fi extrasă ușor prin unul dintre mai multe tratamente chimice diferite (sare bogată, sare săracă, acid ...).

Nivelurile structurii cromatinei sunt ilustrate mai jos.

Extracția sării disociază majoritatea proteinelor de cromatină. Când un extract cu conținut scăzut de sare este centrifugat și peleta resuspendată, cromatina rămasă arată mărgele pe ață. Învelit cu ADN nucleozomi sunt mărgelele, care sunt la rândul lor legate de lungimi uniforme ale „șirului” ADN metaforic ( # 1 în ilustrația de mai sus). Un extract de cromatină bogată în sare apare ca o bobină de nucleozomi sau Fibra solenoidă de 30 nm (# 2 de mai sus). Alte protocoale de extracție au relevat alte aspecte ale structurii cromatinei prezentate în #s 3 și 4 de mai sus. Cromozomii observați în metafaza mitozei sunt „de ordinul cel mai înalt”, cea mai condensată formă a cromatinei.

Filamentul de 10 nm al nucleozomului „perle-pe-un șir” rămas după o extracție cu sare scăzută poate fi văzut la un microscop electronic, așa cum se arată mai jos.

Când aceste coliere de nucleozomi au fost digerate cu enzima dezoxiribonuclează (DNAse), ADN-ul dintre „mărgele” a fost degradat, lăsând în urmă filamente scurtate de 10 nm după o perioadă scurtă de digestie sau doar mărgele simple după o digestie mai lungă (mai jos).

Roger Kornberg (fiul laureatului Nobel Arthur Kornberg care a descoperit prima enzimă ADN polimerază de replicare) a participat la descoperirea și caracterizarea nucleozomilor în timp ce era încă post-doctor! S-a relevat electroforeza ADN-ului extras din aceste digestii nucleozomi separate printr-o întindere de ADN „linker” de aproximativ 80 de perechi de baze. ADN-ul extras din nucleozomi avea aproximativ 147 de perechi de baze. Acesta este ADN-ul care fusese înfășurat în jurul proteinelor nucleozomului.

172 Nucleozomi-ADN și proteine

După separarea tuturor proteinelor de ADN nucleozomal, au fost identificate cinci proteine ​​(ilustrate mai jos).

Histonele sunt proteine ​​de bază care conțin multe lizină și arginină aminoacizi. Lanțurile lor laterale încărcate pozitiv permit acestor aminoacizi să se lege de acidul încărcat negativ coloana vertebrală fosfodiesterică de ADN dublu elicoidal. ADN-ul se înfășoară în jurul unui octamer de histone (câte 2 din cele 4 proteine ​​histonice) pentru a forma nucleozom. Aproximativ un gram de histone este asociat cu fiecare gram de ADN. După o extracție ridicată de cromatină de sare, structura vizibilă în microscopul electronic este solenoidul de 30 nm, bobina nucleozomilor modelată în figura de mai jos.

După cum se arată mai sus, simpla creștere a concentrației de sare a unui preparat de nucleozomi deja extras va face ca „colierul” să se plieze în structura solenoidului de 30 nm.

173 Structura cromatinei: cromatina disecantă

După cum ați putea ghici, o extracție acidă a cromatinei ar trebui să îndepărteze selectiv proteinele histonice de bază, lăsând în urmă o asociere a ADN-ului cu proteinele non-histonice. Acesta s-a dovedit a fi cazul. O micrografie electronică a rămășiței de cromatină după o extracție acidă a cromozomilor metafazici este prezentată pe pagina următoare.

ADN-ul eliberat de nucleozomii pe bază de histone distanțați în mod regulat, se îndepărtează, departe de axa lungă a cromatinei. Materialul întunecat de-a lungul acestei axe este o schelă proteică care formează ceea ce rămâne după extracția histonelor. O mare parte din această proteină este topoizomeraza, o enzimă care împiedică desprinderea ADN-ului sub tulpina de replicare.

174 Histone și proteine ​​non-histone


Reglarea genelor la eucariote

Să facem un studiu aprofundat al reglării genelor în eucariote. După ce ați citit acest articol, veți afla despre: 1. Modificarea cromatinei 2. Controlul transcrierii de către hormoni 3. Reglarea procesării ARNm 4. Controlul duratei de viață a mARN 5. Amplificarea genei 6. Regulamentul post traducere și 7. Tăcere genetică după transcriere.

Introducere în reglementarea genelor:

Expresia genelor poate fi reglată în eucariote prin toate principiile ca cele ale procariotelor. Dar există multe mecanisme suplimentare de control al expresiei genelor în eucariote, deoarece genomul este mult mai mare. Genele sunt prezente în nucleul în care se sintetizează ARNm. ARNm este apoi exportat în citoplasmă unde are loc traducerea.

La eucariote, organizarea este multicelulară și specializată în țesuturi și organe. Celulele sunt diferențiate și celulele unui țesut produc în general o proteină specifică care implică un anumit set de gene. Toate celelalte gene devin definitiv oprite și nu sunt niciodată transcrise.

Caracteristicile structurale ale eucariotelor care influențează expresia genelor sunt prezența nucleozomilor în cromatină, heterocromatina și prezența genelor divizate în cromozomi.

În comparație cu genele procariote, genele eucariote au mult mai multe situri de legare reglatoare și sunt controlate de multe alte proteine ​​reglatoare. Secvențele de reglare pot fi prezente la mii de nucleotide distanță de promotor, pot fi situate în amonte și în aval. Aceste secvențe reglatoare acționează de la distanță. ADN-ul intervenit se elimină, astfel încât secvența reglatoare și promotorul ajung să se așeze unul lângă celălalt.

Cea mai mare parte a reglementării controlului genelor are loc la inițierea nivelului transcripției. Inițierea traducerii influențează, de asemenea, foarte mult reglarea genelor.

Modificarea cromatinei:

Genomul eucariotelor este înfășurat în proteine ​​histonice pentru a forma nucleozomi. Această condiție duce la ascunderea parțială a genelor și reduce expresia genelor.

Ambalarea ADN-ului cu octomeri de histonă nu este permanentă. Orice porțiune de ADN poate fi eliberată din octomer ori de câte ori proteinele care leagă ADN-ul trebuie să acționeze asupra acestuia. Aceste proteine ​​sau enzime care leagă ADN-ul își recunosc situsurile de legare pe ADN numai atunci când este eliberat din octomerul histonelor sau când este prezent pe ADN-ul linker. ADN-ul este desfășurat din nucleozomi.

Această desfășurare a ADN-ului din nucleozomi este realizată de enzimele modificatoare de nucleozomi sau complexul de remodelare a nucleozomilor. Aceștia acționează în diferite moduri. Acestea pot remodela structura octomerului sau pot aluneca octomerul de-a lungul ADN-ului, descoperind astfel siturile de legare a ADN-ului pentru acțiunea proteinelor reglatoare. Astfel, genele sunt activate.

Unii dintre acești modificatori de nucleozomi adaugă grupări acetil (acetilare) la cozile histonelor, slăbând astfel învelișul ADN-ului și în acest proces expun situsurile de legare a ADN-ului. Toate acestea duc la exprimarea genelor. În mod similar, deacetilarea de către deacetilaze determină inactivarea ADN-ului.

Nucleozomii sunt complet absenți în regiunile care sunt active în transcripție, cum ar fi genele ARNr.

Forma densă de cromatină se numește heterocromatină în eucariote. Aceasta duce la inhibarea genei sau la reducerea genei. Heterocromatina este o parte ambalată dens a cromatinei care nu permite expresia genelor. Cromatina ambalată dens nu poate fi transcrisă cu ușurință. Unele enzime fac cromatina mai densă. Telomerii și contromerii sunt sub formă de heterocromatină.

La animalele superioare, aproximativ 50% din genom este sub formă de heterocromatină. Enzimele sunt capabile să modifice densitatea cromatinei prin modificarea chimică a coziilor histonelor. Acest lucru afectează transcrierea.

În acest fel, atât activarea, cât și reprimarea transcripției se realizează prin modificarea cromatinei în heterocromatină și eucromatină.

Metilarea anumitor secvențe de ADN împiedică transcrierea genelor la mamifere. S-a observat că genele, care sunt puternic metilate, nu sunt transcrise, deci nu sunt exprimate. Enzimele ADN metilaze determină metilarea anumitor secvențe de ADN, reducând astfel la tăcere genele.

Controlul transcrierii de către hormoni:

Diverse semnale intercelulare și intracelulare reglează expresia genei.

Hormonii exercită un control considerabil asupra transcrierii. Hormonii sunt substanțe extracelulare sintetizate de glandele endocrine. Ele sunt transportate către celulele țintă îndepărtate. Diferiti hormoni precum insulina, estrogenul, progesteronul, testosteronul, etc. acționează adesea prin & # 8220pornind” transcrierea ADN-ului.

Hormonul la intrarea într-o celulă țintă formează un complex cu receptorul prezent în citoplasmă. Acest complex hormon-receptor intră în nucleu și se leagă de un anumit cromozom prin intermediul unor proteine ​​specifice. Aceasta inițiază transcrierea. Complexul receptor hormonal poate spori sau suprima expresia genelor.

S-a observat la pui că atunci când hormonul estrogen este injectat, oviductul răspunde prin sintetizarea ARNm, care este responsabil pentru sinteza albuminei. Hormonul se leagă direct de ADN și acționează ca un inductor.

Reglarea procesării ARNm:

Genele eucariotelor au regiuni necodificatoare (introni) între regiunile codificante (exoni). Astfel de gene se numesc gene divizate. Întreaga genă este transcrisă pentru a produce ARNm care se numește ARNm precursor sau transcript primar (pre-ARNm). Înainte de a avea loc traducerea, intronii sunt tăiați prin excizie și aruncați. Acest lucru este cunoscut sub numele de procesare a ARNm, iar ARNm procesat se numește ARNm matur. Aceasta participă la sinteza proteinelor. ARNm matur este considerabil mai mic decât ARNm precursor.

Eucariotele superioare au diverse mecanisme prin care pre-ARNm este procesat în moduri alternative sau diferențiale pentru a produce ARNm diferiți care codifică diferite proteine. Proteinele multiple sunt produse dintr-o genă prin procesare alternativă a ARNm. Multe celule profită de diferite căi de îmbinare pentru a modifica expresia genelor și a sintetiza diferite polipeptide. Îmbinarea alternativă a ARNm crește numărul de proteine ​​exprimate de o singură genă eucariotă.

Prelucrarea alternativă a pre-ARNm se realizează prin sărirea exonului, prin păstrarea anumitor introni etc.

Aceste căi alternative de procesare sunt foarte reglementate.

În drosofilă ARNm este procesat în patru moduri diferite, prin urmare produce patru tipuri diferite de miozină proteică musculară. Diferite tipuri de miozină sunt produse în stadii de larvă, pupă și embrionar târziu.

Controlul duratei de viață a mARN:

La procariote durata de viață a unei molecule de ARNm este foarte scurtă, durând doar un minut sau mai puțin. ARNm degenerează imediat după sinteza proteinelor.

Dar, deoarece mARN-ul din eucariote este transportat în citoplasmă prin nucleopori, acest mARN este tradus în mod repetat. Această traducere repetată a ARNm se realizează prin creșterea duratei de viață a ARNm. Într-o celulă foarte diferențiată, o singură moleculă de ARNm cu o durată lungă de viață este capabilă să producă o cantitate mare de proteină unică. Durata de viață a unui ARNm eucariot variază de la câteva ore la câteva zile.

Celulele oviductului de pui au o singură copie a genei ovalbumenului, dar produc o cantitate mare de albumen.

Glanda de mătase a viermilor de mătase produce un fir foarte lung din fibroină proteică, care formează cocon. Glanda de mătase este o singură celulă poliploidă. Produce un număr mare de molecule de ARNm, care au o durată lungă de viață de câteva zile.

Amplificarea genei:

Există un mecanism în diferite organisme prin care numărul de gene este crescut de multe ori fără divizarea mitozei. Aceasta se numește amplificare genică.

În timpul amplificării, ADN-ul suferă în mod repetat o replicare fără separare mitotică în molecule de ADN fiice sau cromatide. Acest lucru permite celulei să producă cantități mari de proteine ​​într-un timp scurt.

Regulamentul post-traducere:

În procariote, o singură moleculă de ARNm policistronic codifică multe proteine ​​diferite. Dar la eucariotele care au ARNm mono-cistronic, sinteza diferitelor proteine ​​se realizează într-un mod diferit. Un singur ARNm produce o polipeptidă mare numită poliproteină. Această poliproteină este apoi scindată în moduri alternative pentru a produce proteine ​​diferite. Fiecare proteină este considerată produsul unei singure gene. În acest sistem, există multe locuri de scindare pe poliproteine.

Post Transcription Gene Silencing:

Multe ARN-uri mici există în eucariote care își joacă rolul în reducerea tăcerii genelor. Acești ARN mici acționează asupra ARNm, ducând la întreruperea traducerii. Acești ARN mici sunt micro ARN-uri (miARN-uri), ARN-uri mici interferente (siARN-uri) și mulți alții.


Identificarea la nivelul genomului a genelor grupate fizic sugerează corregularea la nivelul cromatinei în dezvoltarea reproducerii masculine în Arabidopsis thaliana

Co-exprimarea genelor legate fizic apare surprinzător de frecvent la eucariote. O astfel de agregare cromozomială poate conferi un avantaj selectiv, deoarece permite reglarea coordonată a genelor la nivelul cromatinei. Am studiat organizarea cromozomială a genelor implicate în dezvoltarea reproductivă masculină la Arabidopsis thaliana. Am dezvoltat un instrument in-silico pentru a identifica grupuri fizice de gene co-reglate din datele despre expresia genelor. Am identificat 17 clustere (96 de gene) implicate în dezvoltarea staminei și care acționează în aval de activatorul transcripțional MS1 (MALE STERILITY 1), care conține un domeniu PHD asociat cu reorganizarea cromatinei. Clusterele au prezentat o omologie genetică mică sau asemănarea elementului promotor și s-au suprapus în mare parte cu semnele de histonă represive raportate. Experimentele pe un subset de clustere au sugerat o legătură între activarea expresiei și conformația cromatinei: qRT-PCR și hibridizarea ARNm in situ au arătat că genele grupate au fost reglate în sus în decurs de 48 de ore după inducția MS1 din 14 mutanți de remodelare a cromatinei studiati, expresie. a genelor grupate a fost constant reglementată în jos doar în hta9 / hta11, asociată anterior cu activarea clusterelor metabolice Fluorescența ADN in situ hibridizare a confirmat că activarea transcripțională a genelor grupate a fost corelată cu conformația deschisă a cromatinei. Dezvoltarea staminei pare astfel să implice activarea transcripțională a genelor grupate fizic prin decondensarea cromatinei.

© The Author (s) 2017. Publicat de Oxford University Press în numele Nucleic Acids Research.

Cifre

Identificarea clusterelor fizice co-exprimate ...

Identificarea clusterelor fizice co-exprimate în dezvoltarea stamenului. ( A ) Vedere schematică...

Poziția cromozomală și compoziția genelor...

Poziția cromozomală și compoziția genică a clusterelor. ( A ) Pozitia…

Nivelurile de expresie în muguri florali...

Niveluri de expresie la mugurii florali din diferite stadii de dezvoltare. ( A ) Rudă ...

Descondensare cromozomială estimată de ADN ...

Descondensare cromozomială estimată de ADN FISH. Sonde etichetate cu biotină (portocaliu) sau DIG- (verde) ...


Acetilarea histonei și ansamblul nucleozomilor

Când este examinată prin microscopie electronică la putere ionică scăzută, cromatina nucleozomală seamănă cu un șir de margele cu diametre de aproximativ 10 nm și ADN-ul linker extins între nucleozomi adiacenți (Fig. 13-1). Fiecare nucleozom din cromozomi este asociat de obicei cu aproximativ 200 de perechi de baze de ADN. Cu scăderea a 166 de perechi de baze pentru două spire în jurul histonei octamer, aceasta lasă 34 de perechi de baze de ADN linker între nucleozomii adiacenți. ADN-ul linker poate varia mult în lungime în diferite țesuturi și tipuri de celule.

O a cincea histonă, H1 sau linker histone, se crede că se leagă de ADN-ul linker de pe partea fiecărui miez de nucleozom unde molecula de ADN intră și iese din structură (Fig. 13-5). Histonele H1 au un domeniu central „elicoid cu aripi” flancat de domenii de bază nestructurate atât la capătul N- cât și la cel C-terminal (Fig. 13-3). Mamiferele au cel puțin opt forme variante (numite subtipuri) de histone H1 (H1a – e, H10, H1tși H1oo). Secvențele de aminoacizi ale acestor variante diferă cu 40% sau mai mult. Dintre acestea, H1 0 se găsește în celulele care intră în G nedivizabilo (vezi Capitolul 41), în timp ce H1t și H1oo se găsesc exclusiv în spermatozoizi în dezvoltare și, respectiv, ovocite.

(A, fișier PDB: 1KX5. B, Fișier PDB: 1HST.)


Proliferarea și diferențierea celulelor stem

David C. Klein, Sarah J. Hainer, în Subiecte actuale în biologia dezvoltării, 2020

13.2 Promotorii bivalenți marchează gene slab exprimate, dar echilibrate în celulele ES

În general, cromatina celulei ES este îmbogățită pentru modificări active ale histonelor, cum ar fi H3K4me3 și H3K9ac (revizuită în Meshorer & Misteli, 2006). Cromatina pluripotentă se distinge, totuși, printr-un subset de promotori de gene (între 3000 și 4000) (Li, Lian, Dai, Xiang, & Dai, 2013) marcați atât cu modificări active (H3K4me3) cât și represive (H3K27me3), plasate, respectiv, prin complexe din grupurile Trithorax și Polycomb (PRC2) (Fig. 7). Primele dovezi ale marcajelor de cromatină bivalente în celulele ES murine au fost identificate folosind matrice de oligonucleotide ChIP și de placare unde o regiune mare de H3K27me3 a fost însoțită de patch-uri mai mici de H3K4me3 (Azuara și colab., 2006 Bernstein și colab., 2006). Acești promotori bivalenți marchează gene slab exprimate în celulele nediferențiate și, prin urmare, sunt pregătiți pentru activare ca răspuns la semnalizarea dezvoltării (Azuara și colab., 2006 Bernstein și colab., 2006 Voigt, Tee și Reinberg, 2013). Transcrierea acestor gene este reprimată, dar nu blocată: genele bivalente rămân deschise factorilor de transcripție și, prin urmare, sunt pregătite pentru reglare ascendentă după diferențiere, așa cum este cerut de organism (Voigt și colab., 2013). În timpul diferențierii, o marcă este de obicei pierdută de la promotor, în timp ce cealaltă se îmbogățește în funcție de faptul dacă gena este exprimată sau redusă la tăcere. În celulele ES, cromatina bivalentă este rezolvată prin evacuarea mediată de SWI/SNF a proteinelor PcG (Stanton și colab., 2017) și prin curățarea H3K27me3 determinată de ASF1A (Gao, Gan, Lou și Zhang, 2018). Evacuarea mărcii represive H3K27me3 și a proteinelor PcG responsabile de plasarea acestuia permite dereprimarea genelor de specificare a descendenței bivalente (Stanton și colab., 2017). În concordanță cu starea lor pozitivă, genele bivalente tind să afișeze niveluri scăzute de metilare a ADN-ului, o altă marcă epigenetică represivă, insulele CpG ale liniei germinale și genele Polycomb devenind din ce în ce mai metilate pe măsură ce celulele ES se diferențiază și se angajează în linii specifice (Mohn și colab., 2008 Vastenhouw & amp Schier, 2012). Genele bivalente sunt în mare parte gene de specificații genealogice (cum ar fi membrii familiilor SOX, FOX, PAX, IRX și POU / OCT Bernstein și colab., 2006) și rămân accesibile, dar nu sunt exprimate în celulele ES. Marcajele cromatinei bivalente sunt în mare parte specifice celulelor stem (inclusiv celulele ES, iPSC și celulele stem hematopoietice Cui și colab., 2009 Harikumar & amp Meshorer, 2015). Cu toate acestea, genele bivalente au fost identificate în celulele non-stem, inclusiv celule T diferențiate și unele tipuri de celule canceroase (Bapat și colab., 2010 Barski și colab., 2007 Lin și colab., 2015 McGarvey și colab., 2008 Rodriguez și colab. al., 2008 Roh, Cuddapah, Cui, & Zhao, 2006). În timp ce promotorii bivalenți au fost inițial considerați a fi restricționați la gene reglate de dezvoltare pentru a permite tranziția rapidă între stările de expresie activă și reprimată, este clar că bivalența este mai complexă, deoarece promotorii bivalenți au fost identificați în diferite familii de gene în numeroase tipuri de celule diferite. Mai mult, reglarea stării bivalente este realizată de o mare varietate de proteine ​​și regulatori diferiți care se extind mult dincolo de membrii grupului Trithorax și Polycomb care plasează semnele epigenetice ale bivalenței. Unele regulatoare importante includ complexe de remodelare a nucleozomilor precum Tip60-p400, esBAF, CHD7 și NuRD (Alajem și colab., 2015 Fazzio și colab., 2008b Ho, Jothi și colab., 2009 Lei și colab., 2015 Reynolds, Salmon -Divon și colab., 2012 Schnetz și colab., 2010). Tip60-p400 se co-localizează semnificativ cu H3K4me3, în special în apropierea TSS, iar complexul acționează în principal pentru a reprima expresia genelor în celulele ES (Fazzio și colab., 2008b). Knockdown-ul Tip60-p400 are ca rezultat dereglarea a 4% din gene, dintre care cele mai multe sunt reglate în mod interesant, multe dintre cele descoperite ca fiind reglate în sus erau gene clasice bivalente de diferențiere timpurie, care sunt în mod normal reduse la tăcere în celulele ES (Fazzio și colab., 2008b ). Subunitatea esBAF BAF60A a fost mapată de ChIP-seq pentru a dezvălui o distribuție similară cu cea a H3K27me3 în jurul TSS-urilor, cu îmbogățire semnificativă la promotorii genelor bivalente după epuizarea BAF60A, aceste mărci s-au dovedit a fi redistribuite semnificativ la nivelul genomului (Alajem și colab.). , 2015). În timp ce esBAF tinde să funcționeze ca un activator al expresiei genelor și PRC2 ca un represor, cele două funcționează sinergic pentru a regla corect expresia genelor asociate diferențierii (Ho și colab., 2011). CHD7 se asociază cu un cluster PcG, care conține SUZ12, RING1B și EZH2, sugerând o conexiune între CHD7 și H3K27me3 (Schnetz și colab., 2010). În cele din urmă, NuRD ATPaza CHD4 elimină grupările acetil din H3K27 din celulele ES, permițând astfel recrutarea ulterioară a proteinelor PcG și H3K27me3 (Reynolds, Salmon-Divon, și colab., 2012). CHD4 interacționează, de asemenea, cu H3K4 demetilaza LSD1, care ocupă majoritatea genelor active și aproximativ două treimi din genele bivalente (Whyte și colab., 2012). Factorii de remodelare a nucleozomilor joacă roluri critice în deciziile despre soarta celulelor și menținerea caracteristicilor celulelor stem, în timp ce relațiile lor cu bivalența au fost discutate, secțiunea următoare se va extinde în mod substanțial asupra acestor roluri, precum și asupra altor funcții ale factorilor de remodelare a nucleozomilor în celulele ES.


Eucromatina și heterocromatina

Cromatina dintr-o celulă poate fi compactată în grade diferite, în funcție de stadiul celulei din ciclul celular.

În nucleu, cromatina există ca eucromatină sau heterocromatină. În timpul interfazei ciclului, celula nu se divizează, ci suferă o perioadă de creștere.

Cea mai mare parte a cromatinei este într-o formă mai puțin compactă cunoscută sub numele de eucromatină. Mai mult din ADN este expus în eucromatină, permițând replicarea și transcrierea ADN-ului.

În timpul transcrierii, dubla helix a ADN-ului se desfășoară și se deschide pentru a permite copierea genelor care codifică proteinele. Replicarea și transcrierea ADN sunt necesare pentru ca celula să sintetizeze ADN, proteine ​​și organite în pregătirea diviziunii celulare (mitoză sau meioză).

Un mic procent de cromatină există ca heterocromatină în timpul interfazei. Această cromatină este strâns împachetat, nepermițând transcripția genelor. Heterocromatina se colorează mai întunecată cu coloranți decât eucromatina.


14.5 Replicarea ADN în eucariote

Până la sfârșitul acestei secțiuni, veți putea face următoarele:

  • Discutați despre asemănările și diferențele dintre replicarea ADN la eucariote și procariote
  • Afirmați rolul telomerazei în replicarea ADN-ului

Genomurile eucariote sunt mult mai complexe și de dimensiuni mai mari decât genomurile procariote. Eucariotele au, de asemenea, un număr de cromozomi liniari diferiți. Genomul uman are 3 miliarde de perechi de baze per set haploid de cromozomi, iar 6 miliarde de perechi de baze sunt replicate în timpul fazei S a ciclului celular. Există mai multe origini de replicare pe fiecare cromozom eucariot, oamenii pot avea până la 100.000 de origini de replicare în întregul genom. Rata de replicare este de aproximativ 100 de nucleotide pe secundă, mult mai lentă decât replicarea procariotă. În drojdie, care este un eucariot, secvențe speciale cunoscute sub numele de secvențe de replicare autonomă (ARS) se găsesc pe cromozomi. Acestea sunt echivalente cu originea replicării în E coli.

Numărul de ADN polimeraze din eucariote este mult mai mare decât în ​​procariote: 14 sunt cunoscute, dintre care cinci se știe că au roluri majore în timpul replicării și au fost bine studiate. Sunt cunoscuți sub numele de pol α, pol β, pol γ, pol δ, și pol ε.

Pașii esențiali de replicare sunt aceiași ca în procariote. Înainte ca replicarea să poată începe, ADN-ul trebuie pus la dispoziție ca șablon. ADN-ul eucariotic este legat de proteinele de bază cunoscute sub numele de histone pentru a forma structuri numite nucleozomi. Histonesle trebuie îndepărtate și apoi înlocuite în timpul procesului de replicare, ceea ce ajută la ținerea cont de rata mai scăzută de replicare la eucariote. Cromatina (complexul dintre ADN și proteine) poate suferi unele modificări chimice, astfel încât ADN-ul poate aluneca de pe proteine ​​sau poate fi accesibil enzimelor mașinilor de replicare a ADN-ului. La originea replicării, se face un complex de pre-replicare cu alte proteine ​​inițiator. Helicaza și alte proteine ​​sunt apoi recrutate pentru a începe procesul de replicare (Tabelul 14.2).

ProprietateProcarioteEucariote
Originea replicăriiSingurMultiplu
Rata de replicare1000 nucleotide / s50 la 100 nucleotide / s
Tipuri de ADN polimerază514
TelomerazaNu este prezentPrezent
Îndepărtarea primerului ARNDNA pol IRNase H
Alungirea suviteiADN pol IIIPol α, pol δ, pol ε
Clemă culisantăClemă culisantăPCNA

O helicază care folosește energia din hidroliza ATP deschide helixul ADN-ului. Furcile de replicare se formează la fiecare origine de replicare pe măsură ce ADN-ul se desfășoară. Deschiderea dublei helix provoacă supraînfăşurarea sau supraînfăşurarea ADN-ului înaintea furcii de replicare. Acestea sunt rezolvate cu acțiunea topoizomerazelor. Primerii sunt formați de enzima primază și, folosind primerul, ADN pol poate începe sinteza. Trei ADN polimeraze majore sunt apoi implicate: α, δ și ε. ADN pol α adaugă un fragment de ADN scurt (20 până la 30 de nucleotide) la primerul de ARN de pe ambele catene, apoi transferă la o a doua polimerază. În timp ce firul principal este sintetizat continuu de enzima pol ε, firul întârziat este sintetizat de pol δ. O proteină cu clemă glisantă cunoscută sub numele de PCNA (antigen nuclear celular proliferant) ține polul ADN în loc, astfel încât să nu alunece de pe ADN. Pe măsură ce pol δ intră în ARN-ul primer de pe lanțul întârziat, îl înlocuiește de la matrița de ADN. ARN-ul primerului deplasat este apoi îndepărtat de RNaza H (AKA flap endonucleaza) și înlocuit cu nucleotide ADN. Fragmentele Okazaki din catena întârziată sunt unite după înlocuirea primerilor de ARN cu ADN. Lacunele care rămân sunt sigilate de ADN ligaza, care formează legătura fosfodiester.

Replicarea telomerilor

Spre deosebire de cromozomii procarioti, cromozomii eucarioti sunt liniari. După cum ați aflat, enzima ADN pol poate adăuga nucleotide numai în direcția 5 'la 3'. În catena principală, sinteza continuă până când se ajunge la sfârșitul cromozomului. Pe catena întârziată, ADN-ul este sintetizat în întinderi scurte, fiecare dintre acestea fiind inițiat de un primer separat. Atunci când furculița de replicare ajunge la capătul cromozomului liniar, nu există nicio modalitate de a înlocui grundul de la capătul 5 ’al firului întârziat. ADN-ul de la capetele cromozomului rămâne astfel nepereche, iar în timp aceste capete, numite telomeri, poate deveni progresiv mai scurt pe măsură ce celulele continuă să se divizeze.

Telomerii cuprind secvențe repetitive care nu codifică nicio genă anume. La om, o secvență de șase perechi de baze, TTAGGG, se repetă de 100 până la 1000 de ori în regiunile telomerilor. Într-un fel, acești telomeri protejează genele de a fi șterse, pe măsură ce celulele continuă să se împartă. Telomerii sunt adăugați la capetele cromozomilor printr-o enzimă separată, telomeraza (Figura 14.16), a cărei descoperire a ajutat la înțelegerea modului în care aceste capete cromozomale repetitive sunt menținute. Enzima telomerază conține o parte catalitică și un șablon de ARN încorporat. Se atașează la capătul cromozomului, iar la capătul 3’ al catenei de ADN sunt adăugate nucleotide ADN complementare șablonului de ARN. Odată ce capătul 3’ al șablonului catenei întârziate este suficient de alungit, ADN polimeraza poate adăuga nucleotidele complementare la capetele cromozomilor. Astfel, capetele cromozomilor sunt reproduse.

Telomeraza este de obicei activă în celulele germinale și celulele stem adulte. Nu este activ în celulele somatice adulte. Pentru descoperirea telomerazei și a acțiunii acesteia, Elizabeth Blackburn, Carol W. Greider și Jack W. Szostak (Figura 14.16) au primit Premiul Nobel pentru Medicină și Fiziologie în 2009.

Telomeraza și îmbătrânirea

Celulele care suferă diviziune celulară continuă să aibă telomerii scurtați, deoarece majoritatea celulelor somatice nu produc telomerază. Aceasta înseamnă, în esență, că scurtarea telomerilor este asociată cu îmbătrânirea. Odată cu apariția medicinei moderne, a asistenței medicale preventive și a stilurilor de viață mai sănătoase, durata vieții umane a crescut și există o cerere din ce în ce mai mare ca oamenii să arate mai tineri și să aibă o calitate mai bună a vieții pe măsură ce îmbătrânesc.

În 2010, oamenii de știință au descoperit că telomeraza poate inversa unele condiții legate de vârstă la șoareci. Acest lucru poate avea potențial în medicina regenerativă. 2 Șoareci cu deficit de telomerază au fost utilizați în aceste studii, acești șoareci au atrofie tisulară, epuizare a celulelor stem, insuficiență a sistemului de organe și răspunsuri afectate ale leziunilor tisulare. Reactivarea telomerazei la acești șoareci a determinat extinderea telomerilor, a redus daunele ADN, a inversat neurodegenerarea și a îmbunătățit funcția testiculelor, splinei și intestinelor. Astfel, reactivarea telomerilor poate avea potențial pentru tratarea bolilor legate de vârstă la om.

Cancerul se caracterizează printr-o diviziune necontrolată a celulelor anormale. Celulele acumulează mutații, proliferează necontrolat și pot migra în diferite părți ale corpului printr-un proces numit metastază. Oamenii de știință au observat că celulele canceroase au scurtat considerabil telomerii și că telomeraza este activă în aceste celule. Interesant este că numai după ce telomerii au fost scurtați în celulele canceroase, telomeraza a devenit activă. Dacă acțiunea telomerazei în aceste celule poate fi inhibată de medicamente în timpul terapiei împotriva cancerului, atunci celulele canceroase ar putea fi oprite din divizarea ulterioară.


Formele ADN-ului

Figura 4.13.2 Forme de ADN.

Cu excepția cazului în care o celulă eucariotă se împarte, ADN-ul său nuclear există sub denumirea de material granulos cromatină . Doar odată ce o celulă este pe cale să se divizeze și ADN-ul său s-a reprodus, ADN-ul se condensează și se înfășoară în forma familiară în formă de X a unui cromozom , ca cel prezentat mai jos.

Figura 4.13.3 Diagrama unui cromozom care arată că într-un cromozom cu forma tipică “X”, acesta este format din două bucăți identice de ADN, fiecare numită cromatidă.

Majoritatea celulelor din corpul uman au două perechi de 23 de cromozomi diferiți, pentru un total de 46 de cromozomi. Celulele care au două perechi de cromozomi se numesc diploide. Deoarece ADN-ul s-a replicat deja când se înfășoară într-un cromozom, fiecare cromozom constă de fapt din două structuri identice numite sora cromatide . Cromatidele surori sunt unite într-o regiune numită centromer.


Genome-wide identification of physically clustered genes suggests chromatin-level co-regulation in male reproductive development in Arabidopsis thaliana

Co-expression of physically linked genes occurs surprisingly frequently in eukaryotes. Such chromosomal clustering may confer a selective advantage as it enables coordinated gene regulation at the chromatin level. We studied the chromosomal organization of genes involved in male reproductive development in Arabidopsis thaliana. We developed an in-silico tool to identify physical clusters of co-regulated genes from gene expression data. We identified 17 clusters (96 genes) involved in stamen development and acting downstream of the transcriptional activator MS1 (MALE STERILITY 1), which contains a PHD domain associated with chromatin re-organization. The clusters exhibited little gene homology or promoter element similarity, and largely overlapped with reported repressive histone marks. Experiments on a subset of the clusters suggested a link between expression activation and chromatin conformation: qRT-PCR and mRNA in situ hybridization showed that the clustered genes were up-regulated within 48 h after MS1 induction out of 14 chromatin-remodeling mutants studied, expression of clustered genes was consistently down-regulated only in hta9/hta11, previously associated with metabolic cluster activation DNA fluorescence in situ hybridization confirmed that transcriptional activation of the clustered genes was correlated with open chromatin conformation. Stamen development thus appears to involve transcriptional activation of physically clustered genes through chromatin de-condensation.

© The Author(s) 2017. Published by Oxford University Press on behalf of Nucleic Acids Research.

Cifre

Identification of co-expressed physical clusters…

Identification of co-expressed physical clusters in stamen development. ( A ) Schematic view…

Chromosomal position and gene composition…

Chromosomal position and gene composition of the clusters. ( A ) The position…

Expression levels in floral buds…

Expression levels in floral buds of different developmental stages. ( A ) Relative…

Chromosomal de-condensation estimated by DNA…

Chromosomal de-condensation estimated by DNA FISH. Biotin- (orange) or DIG- (green) labelled probes…


Cuprins

Some coactivators indirectly regulate gene expression by binding to an activator and inducing a conformational change that then allows the activator to bind to the DNA enhancer or promoter sequence. [2] [7] [8] Once the activator-coactivator complex binds to the enhancer, RNA polymerase II and other general transcription machinery are recruited to the DNA and transcription begins. [9]

Histone acetyltransferase Edit

Nuclear DNA is normally wrapped tightly around histones, making it hard or impossible for the transcription machinery to access the DNA. This association is due primarily to the electrostatic attraction between the DNA and histones as the DNA phosphate backbone is negatively charged and histones are rich in lysine residues, which are positively charged. [10] The tight DNA-histone association prevents the transcription of DNA into RNA.

Many coactivators have histone acetyltransferase (HAT) activity meaning that they can acetylate specific lysine residues on the N-terminal tails of histones. [4] [7] [11] In this method, an activator binds to an enhancer site and recruits a HAT complex that then acetylates nucleosomal promoter-bound histones by neutralizing the positively charged lysine residues. [7] [11] This charge neutralization causes the histones to have a weaker bond to the negatively charged DNA, which relaxes the chromatin structure, allowing other transcription factors or transcription machinery to bind to the promoter (transcription initiation). [4] [11] Acetylation by HAT complexes may also help keep chromatin open throughout the process of elongation, increasing the speed of transcription. [4]

Acetylation of the N-terminal histone tail is one of the most common protein modifications found in eukaryotes, with about 85% of all human proteins being acetylated. [12] Acetylation is crucial for synthesis, stability, function, regulation and localization of proteins and RNA transcripts. [11] [12]

HATs function similarly to N-terminal acetyltransferases (NATs) but their acetylation is reversible unlike in NATs. [13] HAT mediated histone acetylation is reversed using histone deactetylase (HDAC), which catalyzes the hydrolysis of lysine residues, removing the acetyl group from the histones. [4] [7] [11] This causes the chromatin to close back up from their relaxed state, making it difficult for the transcription machinery to bind to the promoter, thus repressing gene expression. [4] [7]

Examples of coactivators that display HAT activity include CARM1, CBP and EP300. [14] [15]

Corepression Edit

Many coactivators also function as corepressors under certain circumstances. [5] [9] Cofactors such as TAF1 and BTAF1 can initiate transcription in the presence of an activator (act as a coactivator) and repress basal transcription in the absence of an activator (act as a corepressor). [9]

Biological significance Edit

Transcriptional regulation is one of the most common ways for an organism to alter gene expression. [16] The use of activation and coactivation allows for greater control over when, where and how much of a protein is produced. [1] [7] [16] This enables each cell to be able to quickly respond to environmental or physiological changes and helps to mitigate any damage that may occur if it were otherwise unregulated. [1] [7]

Associated disorders Edit

Mutations to coactivator genes leading to loss or gain of protein function have been linked to diseases and disorders such as birth defects, cancer (especially hormone dependent cancers), neurodevelopmental disorders and intellectual disability (ID), among many others. [17] [5] Dysregulation leading to the over- or under-expression of coactivators can detrimentally interact with many drugs (especially anti-hormone drugs) and has been implicated in cancer, fertility issues and neurodevelopmental and neuropsychiatric disorders. [5] For a specific example, dysregulation of CREB-binding protein (CBP)—which acts as a coactivator for numerous transcription factors within the central nervous system (CNS), reproductive system, thymus and kidneys—has been linked to Huntington's Disease, leukaemia, Rubinstein-Taybi syndrome, neurodevelopmental disorders and deficits of the immune system, hematopoiesis and skeletal muscle function. [14] [18]

As drug targets Edit

Coactivators are promising targets for drug therapies in the treatment of cancer, metabolic disorder, cardiovascular disease and type 2 diabetes, along with many other disorders. [5] [19] For example, the steroid receptor coactivator (SCR) NCOA3 is often overexpressed in breast cancer, so the development of an inhibitor molecule that targets this coactivator and decreases its expression could be used as a potential treatment for breast cancer. [15] [20]

Because transcription factors control many different biological processes, they are ideal targets for drug therapy. [14] [21] The coactivators that regulate them can be easily replaced with a synthetic ligand that allows for control over an increase or decrease in gene expression. [14]

Further technological advances will provide new insights into the function and regulation of coactivators at a whole-organism level and elucidate their role in human disease, which will hopefully provide better targets for future drug therapies. [14] [15]

To date there are more than 300 known coregulators. [15] Some examples of these coactivators include: [22]


Priveste filmarea: APBio, Pt2: Regulation of Gene Expression in Eukaryotes and Gene Mutations (Ianuarie 2022).