Informație

De ce pH-ul ridicat duce la denaturarea ADN-ului?


În metoda Southern blot, de exemplu, se utilizează o soluție de NaOH pentru a denatura ADN-ul din probă. Găsesc acest contraintuitiv, deoarece mă așteptam ca $ text {Na} ^ + $ cationii să neutralizeze sarcinile negative ale grupurilor de fosfați, stabilizând astfel dubla helix.


PKas de guanină (neutră) și timină sunt 9-10 (ref). La pH ridicat (>~10), acele baze vor fi deprotonate și vor exista ca baze conjugate încărcate negativ. Ca specie deprotonată, o parte a rețelelor de legare a hidrogenului G / C și A / T sunt eliminate. În figura de mai jos, liniile punctate verzi reprezintă legăturile de hidrogen care explică asocierea bazelor observate. Liniile punctate roșii reprezintă interacțiuni perturbate.


Hipercromicitate

Hipercromicitate este creșterea absorbanței (densitate optica) a unui material. Cel mai faimos exemplu este hipercromicitatea ADN-ului care apare atunci când duplexul ADN este denaturat. [1] Absorbția UV este crescută atunci când cele două catene ADN sunt separate, fie prin căldură, fie prin adăugare de denaturant sau prin creșterea nivelului de pH. Dimpotrivă, se numește o scădere a absorbanței hipocromicitate.

Denaturarea termică a ADN-ului, numită și topire, face ca structura cu dublă helix să se relaxeze pentru a forma ADN monocatenar. Când ADN-ul din soluție este încălzit peste temperatura de topire (de obicei mai mare de 80 ° C), ADN-ul dublu catenar se desfășoară pentru a forma ADN monocatenar. Bazele devin neumplute și astfel pot absorbi mai multă lumină. În starea lor nativă, bazele ADN absorb lumina în regiunea lungimii de undă de 260 nm. Când bazele se dezumplă, lungimea de undă a absorbanței maxime nu se schimbă, dar cantitatea absorbită crește cu 37%. O catenă de ADN cu catenă dublă, care se disociază la două cateni unice, produce o tranziție ascuțită de cooperare.

Hiperchromicitatea poate fi utilizată pentru a urmări starea ADN-ului pe măsură ce se schimbă temperatura. Temperatura de tranziție/topire (Tm) este temperatura în care absorbanța luminii UV este de 50% între maxim și minim, adică unde 50% din ADN este denaturat. O creștere de zece ori a concentrației de cationi monovalenți crește temperatura cu 16,6 ° C.

The efect hipercromic este creșterea uimitoare a absorbției ADN-ului la denaturare. Cele două catene de ADN sunt legate în principal prin interacțiunile de stivuire, legăturile de hidrogen și efectul hidrofob dintre bazele complementare. Legătura de hidrogen limitează rezonanța inelului aromatic, astfel încât și absorbanța probei este limitată. Când dubla helix ADN este tratată cu agenți denaturați, forța de interacțiune care deține structura dublă elicoidală este întreruptă. Elica dublă se separă apoi în două fire simple, care se află în conformația înfășurată aleatoriu. În acest moment, interacțiunea bază-bază va fi redusă, crescând absorbanța UV a soluției de ADN deoarece multe baze sunt în formă liberă și nu formează legături de hidrogen cu baze complementare. Ca urmare, absorbanța pentru ADN monocatenar va fi cu 37% mai mare decât cea pentru ADN dublu catenar la aceeași concentrație.


Liză alcalină

Biologii moleculari folosesc adesea denaturarea alcalină pentru a izola ADN-ul plasmidic de bacterii. Plasmidele sunt bucle mici de ADN separate de cromozomul bacterian. Într-o miniprep de liză alcalină, biologii adaugă detergent și hidroxid de sodiu la bacteriile suspendate în soluție. Detergentul dizolvă membrana celulară bacteriană în timp ce hidroxidul de sodiu mărește pH-ul și face soluția foarte alcalină. Pe măsură ce celulele rupte își eliberează conținutul, ADN-ul din interior se separă în firele sale componente sau se denaturează.


2 Răspunsuri 2

Componenta principală a albușului de ou, ovalbumina, conține 93 de reziduuri încărcate negativ (Asp + Glu) și 68 de reziduuri încărcate pozitiv (Arg + Lys), precum și 14 His. Dacă faceți solventul mai puțin polar adăugând etanol în apă, acestea vor tinde să formeze speciile neutre (Arg + și Lys + vor pierde un proton, iar Glu- și Asp- vor prelua un proton).

Dacă ați avea deja proteina desfăcută, v-ați aștepta ca soluția să devină mai bazică dacă efectul asupra tuturor aminoacizilor încărcați este același, deoarece există mai mulți încărcați negativ.

Pentru a testa dacă efectul observat are legătură cu denaturarea proteinelor sau cu modificări ale stării de protonație a lanțurilor laterale deja expuse la apă, puteți măsura pH-ul aminoacizilor (de preferință, cu o modificare a lanțului principal al acidului carboxilic și a funcțiilor amino deci numai lanţurile laterale prezintă reacţii acid/bază) la diferite concentraţii de etanol.

Majoritatea proteinelor sunt polielectroliți deoarece aminoacizii constituenți pot avea grupări ionizabile, de obicei grupări carboxilice și bazice (imino, guanidino) pe catenele laterale, în plus față de grupările amino și carboxilice terminale (când nu sunt modificate). Gradul de ionizare depinde de pliul proteinei și de pH-ul soluției. Denaturarea unei proteine ​​poate expune la lanțurile laterale îngropate de solvent cu grupări ionizabile, rezultând reacții acide / bazice cu apă.

Dacă soluția este tamponată și proteina nu este prezentă la concentrații mari, atunci gradul de ionizare a proteinei va depinde de pH-ul soluției, dar pH-ul soluției nu va fi deosebit de sensibil la prezența proteinei. Pe de altă parte, dacă există o mulțime de proteine ​​în soluție și / sau soluția nu este tamponată astfel încât să reziste schimbărilor în gradul de ionizare a proteinei, atunci astfel de modificări se vor traduce în modificări ale pH-ului. Concret, modificările în structura secundară sau superioară a proteinei se vor traduce prin modificări ale pH-ului, așa cum se pare că observați.

Din păcate (așa cum sa menționat în comentarii), pH-ul măsurat al probei poate varia puternic cu concentrația de etanol chiar și în absența proteinelor și în prezența tamponului. Aceasta se adaugă efectului pe care solventul organic îl va avea asupra constantei de disociere a grupărilor ionizabile asupra proteinei observate de Karsten Theis. Este destul de probabil ca aceste efecte să o depășească ca importanță pe cea a denaturarii, deoarece grupurile încărcate sunt cel mai adesea expuse pe suprafața proteinei. Gradul de expunere și constanta de disociere pot crește odată cu denaturarea, desigur, iar desfacerea diferitelor efecte nu este simplă, necesitând măsurători precise.

Pentru început, ați putea verifica măsura în care adăugarea de alcool poate fi responsabilă pentru creșterea pH-ului. S-a făcut deja multă muncă în măsurarea unor astfel de efecte, iar următorul tabel compilează câteva rezultate raportate în Compendiul IUPAC de chimie analitică (Ref. 1) pentru tamponul de 0,05 m hidrogen ftalat de potasiu (KHPh).

Alte postări de pe acest site abordează măsurarea pH-ului în mediul organic.

$ begin hline ext hline begin T (° C) & amp0.0416 & amp 0.0891 & amp 0.2068 & amp 0.4771 hline -5.0000 & amp 4.2660 & amp 4.5700 & amp 5.1120 & amp 5.5270 0.0000 & amp 4,2490 & amp 4.5440 & amp 5.0760 & amp 5.5000 10.0000 & amp 4.2350 & amp 4.5130 & amp 5.0260 & amp 5.4690 25,0000 & amp 4,2360 & amp 4,5080 & amp 4,9760 & amp 5,4720 40,0000 & amp 4,2600 & amp 4,5340 & amp 4,9780 & amp 5,4930 hline hlineSfârșit$


Biologie: Poate un pH scăzut să denatureze o enzimă sau este doar un pH ridicat?

Da, pH-urile peste și sub valorile optime pot denatura enzimele din același motiv

Enzimele sunt sensibile la alte condiții decât cele optime.
pH mai mare = Denaturare
pH mai scăzut = Denaturare
Temperatura mai mare = Denaturare
Temperatură mai scăzută = Lucrați prea încet pentru a menține reacțiile din corp.

Pentru a răspunde la întrebarea dvs.:
Da, un pH scăzut poate de asemenea denatura o enzimă. Nu contează dacă este un pH mai mare decât cel normal sau un pH mai mic decât cel normal dacă există o modificare a pH-ului, atunci va schimba forma sitului activ și va face enzima inutilă.

(Postarea originală de AlexeiLipov)
Enzimele sunt sensibile la alte condiții decât cele optime.
PH mai mare = Denaturare
PH mai mic = Denaturare
Temperatura mai ridicată = Denaturare
Temperatură mai scăzută = Lucrați prea încet pentru a menține reacțiile din corp.

Pentru a răspunde la întrebarea dvs.:
Da, un pH scăzut poate denatura și o enzimă. Nu contează dacă este un pH mai mare decât cel normal sau un pH mai mic decât cel normal dacă există o modificare a pH-ului, atunci va schimba forma sitului activ și va face enzima inutilă.


Revizuirea activității enzimatice în 26 de întrebări ușoare

Catalizatorii sunt substanțe care reduc energia de activare a unei reacții chimice, facilitând-o sau făcând-o viabilă din punct de vedere energetic. Catalizatorul mărește viteza de reacție chimică.

Mai multe întrebări și răspunsuri de dimensiuni mici, mai jos

2. Ce cantitate de catalizator este consumată în reacția pe care o catalizează?

Catalizatorii nu sunt consumați în reacțiile pe care le catalizează.

3. Există o diferență între nivelurile de energie inițiale și finale în reacțiile catalizate și necatalizate?

Cataliza nu modifică starea energiei reactivilor și a produselor unei reacții chimice. Numai energia necesară pentru ca reacția să apară, adică energia de activare, este modificată.

4. Ce sunt enzimele? Care este importanța enzimelor pentru ființele vii?

Enzimele sunt proteine ​​care sunt catalizatori ai reacțiilor chimice. Chimia ne arată că catalizatorii sunt substanțe neconsumabile care reduc energia de activare necesară pentru a avea loc o reacție chimică.

Enzimele sunt foarte specifice reacțiilor pe care le catalizează. Ele sunt de o importanță vitală pentru viață deoarece majoritatea reacțiilor chimice din celule și țesuturi sunt catalizate de enzime. Fără acțiunea enzimatică, acele reacții nu ar avea loc sau nu s-ar întâmpla cu viteza necesară proceselor biologice în care sunt implicate.

Complexul enzimă-substrat

5. Ce sunt substraturile reacțiilor enzimatice?

Substraturile sunt molecule de reactivi asupra cărora acționează enzimele.

Enzimele au locuri de legare spațială pentru a se atașa de substratul lor. Aceste locuri sunt numite centre de activare ai enzimei. Substraturile se leagă de acești centri, formând complexul enzimă-substrat.

6. Care sunt principalele modele teoretice care încearcă să explice formarea complexului enzimă-substrat?

Există două modele principale care explică formarea complexului enzimă-substrat: modelul de blocare și cheie și modelul de potrivire indusă.

În modelul de blocare și cheie, enzima are o regiune cu o conformație spațială specifică pentru legarea substratului. În modelul de potrivire indusă, legarea substratului induce o schimbare în configurația spațială a enzimei pentru a face substratul să se potrivească.

7. Cum explică formarea complexului enzimă-substrat reducerea energiei de activare a reacțiilor chimice?

Enzima poate funcționa ca o eprubetă în care reactanții se întâlnesc pentru a forma produse. Enzimele facilitează această întâlnire, făcând mai ușor să apară coliziuni între reactivi și, ca urmare, energia de activare a reacției chimice este redusă. Aceasta este o posibilă ipoteză.

8. De ce nivel structural al enzimei (primar, secundar, terțiar sau cuaternar) depinde interacțiunea enzimă-substrat?

Substratul se leagă de enzimă la centrele de activare. Acestea sunt situri tridimensionale specifice și, prin urmare, depind de structurile terțiare și cuaternare ale proteinei. Structurile primare și secundare condiționează însă celelalte structuri și, în consecință, sunt la fel de importante.

Selectați orice întrebare pentru a o distribui pe FB sau Twitter

Doar selectați (sau faceți dublu clic) pe o întrebare pentru a partaja. Provocați-vă prietenii de pe Facebook și Twitter.

Specificitatea acțiunii enzimatice

9. Care este centrul de activare al unei enzime? Este cheia sau încuietoarea din modelul de lacăt și cheie?

Centrul de activare este o regiune a enzimei produsă de conformația sa spațială de care se leagă substratul. În modelul de blocare și cheie, centrul de activare este blocarea, iar substratul este cheia.

10. De ce acțiunea enzimatică este considerată extrem de specifică?

Acțiunea enzimatică este foarte specifică, deoarece numai substraturile specifice unei enzime se leagă de centrul de activare al enzimei respective. Fiecare enzimă catalizează în general doar o reacție chimică specifică.

Factori care modifică activitatea enzimatică

11. Ce se întâmplă cu funcționalitatea unei enzime denaturate? Cum poate fi explicat acest rezultat cu ajutorul modelului de blocare și cheie?

În funcție de lacăt și cheie, funcționalitatea enzimei depinde în întregime de integritatea centrului de activare, o regiune moleculară cu caracteristici spațiale specifice. După denaturare, conformația spațială a proteinei este modificată, centrul de activare este distrus și enzima își pierde activitatea catalitică.

12. Care sunt principalii factori care modifică viteza reacțiilor enzimatice?

Principalii factori care modifică viteza reacțiilor enzimatice sunt temperatura, pH-ul și concentrația substratului (cantitatea).

13. Cum afectează concentrația substratului viteza reacțiilor enzimatice?

Inițial, pe măsură ce concentrația substratului crește, viteza reacției crește. Acest lucru se întâmplă deoarece centrele de activare libere ale enzimei se leagă de substraturi libere. Odată ce toți centrele de activare ale enzimelor disponibile sunt legate de substraturile lor, noi creșteri ale concentrației substratului nu vor avea niciun efect asupra vitezei reacției.

14. Cum afectează temperatura acțiunea enzimelor asupra substraturilor lor?

Există intervale de temperatură definite sub care funcționează enzimele și există un nivel specific de temperatură (temperatura optimă) în care enzimele au o eficiență maximă. Prin urmare, variațiile de temperatură afectează activitatea enzimei și viteza reacțiilor pe care le catalizează.

În plus, deoarece sunt proteine, enzimele pot fi denaturate la temperaturi extreme.

15. În ceea ce privește reacțiile enzimatice, cât de diferite sunt curbele graficului variației vitezei unei reacții în funcție de concentrația substratului și graficul variației vitezei unei reacții în funcție de temperatură?

Curba de variație a vitezei reacției enzimatice în funcție de creșterea concentrației de substrat਌rește într-o formare de curbă până la apropierea de punctul în care se stabilizează datorită saturațieiꃎntrelor de activare a enzimelor.

Curba de variație a vitezei reacției enzimatice în funcție de creșterea temperaturii crește inițial și apoi atinge un vârf (temperatura optimă), după care scade la zero în punctul în care enzimele devin inactive prin denaturare.

16. & # Xa0 Care este relația dintre & # xa0 & # xa0 răcirea organelor și țesuturilor pentru transplanturi medicale și efectul temperaturii asupra reacțiilor enzimatice?

Degradarea moleculară în timpul descompunerii organelor și țesuturilor este catalizată de enzime. Răcirea la temperaturi adecvate a unor organe și țesuturi destinate transplantului reduce activitatea enzimatică și astfel scade procesul natural de descompunere. Prin același motiv, răcirea reduce activitatea metabolică a celulelor și previne ruperea propriilor structuri pentru a obține energie. O creștere ulterioară a temperaturii revine la denaturarea enzimelor, permițând organelor și țesuturilor, de asemenea, conservate prin alte tehnici specifice, să fie altoite în receptori.

17. pH-ul afectează activitatea enzimelor?

Concentrația ionilor de hidrogen într-o soluție afectează activitatea enzimei. Fiecare enzimă are o eficiență maximă într-un pH optim.

Deoarece pH-ul este unul dintre factorii în denaturarea proteinelor, dacă o enzimă este supusă unui nivel de pH sub care este denaturată, nu va exista activitate enzimatică.

18. Acționează enzimele mai bine sub pH-uri acide sau alcaline?

Majoritatea enzimelor acționează sub pH între 6 și 8, un interval care corespunde nivelului acid general al celulelor și al sângelui. Există totuși enzime care acționează doar sub pH foarte acid sau foarte alcalin. Prin urmare, activitatea enzimei depinde de domeniul pH-ului.

În stomac, de exemplu, sucul gastric are un pH foarte scăzut, în jur de 2. Cu toate acestea, enzima pepsină acționează pentru a digera intens proteinele. În duoden, secrețiile pancreatice măresc pH-ul sucului intestinal pentru a permite altor enzime digestive, cum ar fi tripsina, să acționeze.

19. Deoarece pepsina este o enzimă gastrică, are pH-ul optim acid sau alcalin? Ce se întâmplă cu pepsina când intră în duoden?

Pepsina acționează în stomac, astfel încât pH-ul său optim este de aproximativ 2, un pH acid. Atunci când enzima intră în duoden, aceasta intră în contact cu un pH mai mare și activitatea enzimatică a acestuia ajunge și se termină.

Cofactori

20. Ce sunt cofactorii enzimatici?

Unele enzime au nevoie de alte molecule asociate pentru a funcționa. Aceste molecule sunt numite cofactori enzimatici și pot fi ioni organici precum sărurile minerale sau molecule organice, pentru a da câteva exemple.

Enzimele inactive care nu sunt legate de cofactorii lor se numesc apoenzime. Enzimele active legate de cofactorii lor se numesc holoenzime.

21. Care este relația dintre vitamine și cofactorii enzimatici?

Multe vitamine sunt cofactori enzimatici care nu pot fi sintetizați de organism și, ca urmare, trebuie obținute din dietă.

Inhibitori enzimatici, alosterism și zimogeni

22. Într-o reacție enzimatică, care este efectul unei substanțe cu aceeași conformație spațială ca substratul enzimatic? Cum este recunoscut acest tip de substanță?

Substanțele care „simulează” substraturi se pot lega de centrul de activare al enzimelor, blocând astfel adevăratele substraturi să nu se lege de aceste enzime și paralizând reacția enzimatică. Aceste „substraturi false” sunt numite inhibitori de enzime.

Legarea inhibitorilor enzimatici de enzime poate fi reversibilă sau ireversibilă.

Multe medicamente, inclusiv unele antibiotice, antivirale, antineoplastice, antihipertensive și chiar sildenafil (denumirea comercială Viagra), sunt inhibitori enzimatici care blochează activitatea enzimei.

23. Care este mecanismul de acțiune al antibioticului penicilină?

Penicilina, descoperită de medicul scoțian Alexander Fleming în 1928, este un medicament care inhibă enzimele necesare pentru sinteza peptidoglicanilor, o componentă a peretelui celular bacterian. Prin aceasta, inhibarea populației bacteriene încetează să crească deoarece nu există o nouă formare a peretelui celular.

Fleming a câștigat Premiul Nobel pentru medicină pentru descoperirea penicilinei.

24. Care este mecanismul de acțiune al medicamentelor antiretrovirale numite inhibitori de protează care sunt utilizați împotriva infecției cu HIV?

Inhibitorii de protează sunt unele dintre medicamentele antiretrovirale utilizate pentru tratarea infecției cu HIV. Proteaza este o enzimă necesară pentru construirea  virusului imunodeficienței umane (HIV)਍upă sinteza proteinelor sale în celula gazdă. Inhibitorul de protează se leagă de centrul de activare al enzimei blocând formarea complexului enzimă-substrat și a activității enzimei, oprind astfel replicarea virală.

25. Ce sunt enzimele alosterice?

Enzimele alosterice sunt enzime cu mai multe centre de activare și de care se leagă alte substanțe, numite regulatori alosterici.

Regulatorii alosterici pot fi inhibitori alosterici sau activatori alosterici. Interacțiunea dintre o enzimă alosterică și un inhibitor alosteric interzice legarea substratului de enzimă. Interacțiunea dintre o enzimă alosterică și un activator alosteric permite legarea substratului de enzimă și uneori crește afinitatea enzimei pentru substrat. Acest fenomen reglator al activității enzimatice se numește alosterism.

26. Ce sunt zimogenii?

Zimogenii sau proenzimele sunt enzime secretate sub formă inactivă. În anumite condiții, un zimogen se transformă în forma activă a enzimei. În general, secrețiile de zimogen se întâmplă deoarece activitatea enzimei poate dăuna țesutului secretor.

De exemplu, pepsinogenul secretat de stomac devine activ sub un pH acid, transformându-se în enzima pepsină. Alți zimogeni cunoscuți sunt tripsinogenul și chimotripsinogenul, enzime care sunt secretate de pancreasul exocrin și care devin tripsină și, respectiv, chimotripsină.


De ce pH-ul ridicat duce la denaturarea ADN-ului? - Biologie

BISC411
BIOLOGIA MOLECULARĂ EXPERIMENTALĂ A CELULUI

Principiile electroforezei în gel de poliacrilamidă (PAGE)

S-au dezvoltat tehnici electroforetice puternice pentru a separa macromoleculele pe baza greutății moleculare. Mobilitatea unei molecule într-un câmp electric este invers proporțională cu frecarea moleculară, care este rezultatul dimensiunii și formei sale moleculare și direct proporțională cu tensiunea și sarcina moleculei. Proteinele ar putea fi rezolvate electroforetic într-o matrice semi-solidă strict pe baza greutății moleculare dacă, la o tensiune stabilită, s-ar putea găsi o modalitate de a încărca aceste molecule în același grad și în același semn. În aceste condiții, mobilitatea moleculelor ar fi pur și simplu invers proporțională cu mărimea lor.

Tocmai această idee este exploatată în PAGE pentru a separa polipeptidele în funcție de greutățile lor moleculare. În PAGE, proteinele încărcate negativ prin legarea detergentului anionic SDS (dodecil sulfat de sodiu) se separă într-o matrice de gel de poliacrilamidă într-un câmp electric în funcție de greutățile lor moleculare.
Poliacrilamida se formează prin polimerizarea moleculei de monomer-acrilamidă reticulată prin N, N'-metilen-bis-acrilamidă (prescurtat BIS). Radicalii liberi generați de persulfat de amoniu (APS) și un catalizator care acționează ca un agent de eliminare a oxigenului (-N, N, N ', N'-tetrametiletilen diamină [TEMED]) sunt necesari pentru a începe polimerizarea, deoarece acrilamida și BIS nu sunt reactive de la sine sau când sunt amestecate împreună.

Avantajul distinct al sistemelor de gel de acrilamidă este că concentrațiile inițiale de acrilamidă și BIS controlează duritatea și gradul de reticulare a gelului. Duritatea unui gel controlează la rândul său fricțiunea pe care o experimentează macromoleculele pe măsură ce se mișcă prin gel într-un câmp electric și, prin urmare, afectează rezoluția componentelor care trebuie separate. Gelurile dure (12-20% acrilamidă) întârzie mai mult migrarea moleculelor mari decât cele mici. În anumite cazuri, gelurile de acrilamidă cu concentrație mare sunt atât de strânse încât exclud moleculele mari de la pătrunderea în gel, dar permit migrarea și rezoluția componentelor cu greutate moleculară mică ale unui amestec complex. Alternativ, într-un gel liber (4-8% acrilamidă), moleculele cu greutate moleculară mare migrează mult mai departe în jos și, în unele cazuri, se pot deplasa chiar din matrice.

Electroforeză în gel poliacrilamidă SDS (SDS-PAGE)

Dodecil sulfatul de sodiu (SDS sau laurilsulfatul de sodiu) este un detergent anionic care denaturează moleculele proteinelor fără a rupe legăturile peptidice. Se leagă puternic de toate proteinele și creează un raport foarte mare și constant de încărcare: masă pentru toate proteinele denaturate. După tratamentul cu SDS, indiferent de sarcinile lor native, toate proteinele capătă o sarcină negativă ridicată.

Denaturarea proteinelor se realizează prin încălzirea lor într-un tampon care conține un agent solubil de reducere a tiolului (de exemplu 2-mercaptoetanol ditiotreitol) și SDS. Mercaptoetanolul reduce toate legăturile disulfidice ale reziduurilor de cisteină la grupări sulfhidril libere, iar încălzirea în SDS perturbă toate interacțiunile proteice intra și intermoleculare. Acest tratament produce lanțuri polipeptidice individuale care poartă o sarcină negativă în exces indusă de legarea detergentului și un raport sarcină:masă identic. După aceea, proteinele denaturate pot fi rezolvate electroforetic strict pe baza dimensiunii într-un gel de poliacrilamidă tamponat care conține SDS și agenți de reducere a tiolului.

Sistemele de gel SDS-PAGE sunt extrem de utile în analiza și rezolvarea amestecurilor complexe de proteine. Multe aplicații și modificări ale acestei tehnici sunt relevante pentru biologii experimentali moderni. Unele sunt menționate mai jos. Acestea sunt folosite pentru a monitoriza purificarea enzimei, pentru a determina compoziția subunității proteinelor oligomerice, pentru a caracteriza componentele proteice ale organelor și membranelor subcelulare și pentru a atribui proteinele specifice unor gene specifice prin compararea extractelor de proteine ​​ale organismelor de tip sălbatic și ale mutanților suprimabili. În plus, mobilitatea polipeptidelor în sistemele de gel SDS-PAGE este proporțională cu inversul jurnalului greutăților lor moleculare. Această proprietate face posibilă măsurarea greutății moleculare a unei proteine ​​necunoscute cu o precizie de +/- 5%, rapid, ieftin și reproductibil.

Electroforeză în gel de poliacrilamidă SDS discontinuă

Gelurile disc sunt construite cu două geluri de acrilamidă diferite, unul peste celălalt. Gelul superior sau stivuitor conține 4-5% acrilamidă (un gel foarte slab) slab tamponat la pH 9,0. Gelul cu rezoluție inferioară (denumit adesea gel de rulare), conține o concentrație mai mare de acrilamidă sau un gradient de acrilamidă, puternic tamponat la pH 9,0. Ambele geluri pot fi turnate sub formă de tuburi în cilindri de sticlă sau plastic (geluri tubulare), sau ca plăci subțiri în plăci de sticlă, un aranjament care îmbunătățește considerabil rezoluția și care face posibilă analizarea și compararea multor probe de proteine ​​simultan și pe același gel (geluri de placă). Astăzi, veți construi și rulați geluri pentru plăci.

Discontinuitatea puterii ionice dintre gelul de stivuire slab și gelul cu funcționare dură duce la o discontinuitate a tensiunii pe măsură ce se aplică curent. Scopul acestor geluri este de a maximiza rezoluția moleculelor de proteine ​​prin reducerea și concentrarea probei într-o zonă ultra subțire (1-100 nm) la gelul de stivuire: limita gelului de rulare. Proba de proteină este aplicată într-un godeu din gelul de stivuire ca o coloană lichidă destul de lungă (0,2-0,5 cm), în funcție de cantitatea și grosimea gelului sau tubului. Proba de proteine ​​conține glicerol sau zaharoză, astfel încât să poată fi suprapusă cu un tampon care rulează. Acest tampon se numește tampon de rulare, iar dispunerea este astfel încât partea de sus și de jos a gelului se află în tampon de rulare pentru a crea un circuit.

Pe măsură ce se aplică curent, proteinele încep să migreze în jos prin gelul de stivuire către polul pozitiv, deoarece sunt încărcate negativ de SDS legat. Deoarece gelul de stivuire este foarte slab, proteinele cu greutate moleculară mică și medie nu sunt împiedicate în migrarea lor și se mișcă mult mai repede decât în ​​gelul care rulează. În plus, puterea ionică mai mică a gelului de stivuire (tampon slab) creează o rezistență electrică mare, (adică, un câmp electric mare V/cm) pentru a face proteinele să se miște mai repede decât în ​​gelul de rulare (tărie ionică mare, rezistență mai mică, deci câmp electric mai mic, V / cm). Amintiți-vă că tensiunea aplicată are ca rezultat fluxul de curent în gel prin migrarea ionilor. Prin urmare, puterea ionică scăzută înseamnă rezistență ridicată, deoarece sunt prezenți mai puțini ioni pentru a disipa tensiunea, iar câmpul electric (V/cm) este crescut, determinând migrarea rapidă a proteinelor înalt polianionice.

Migrarea rapidă a proteinelor prin gelul de stivuire le face să se acumuleze și să se stivuească ca o zonă foarte subțire la limita gelului de stivuire/gel de rulare și, cel mai important, deoarece gelul de stivuire 4-5% afectează mobilitatea componentelor mari doar puțin. , stiva este aranjată în ordinea mobilității proteinelor din amestec. Acest efect de stivuire are ca rezultat o rezoluție superioară în cadrul gelului care rulează, unde polipeptidele intră și migrează mult mai lent, în funcție de dimensiunea și forma lor.

În toate sistemele de gel, un colorant de urmărire (de obicei albastru de bromofenol) este introdus cu proba de proteine ​​pentru a determina ora la care operația trebuie oprită. Albastrul de bromofenol este o moleculă mică care se deplasează esențial fără obstacole chiar în spatele frontului ionic, deplasându-se spre fundul gelului. Puține molecule de proteine ​​călătoresc înaintea acestui colorant de urmărire. Când partea din față a vopselei ajunge în partea de jos a gelului curent, curentul este oprit pentru a se asigura că proteinele nu se electroforează din gel în rezervorul tampon.

Vizualizarea proteinelor

Gelurile sunt îndepărtate din tuburi sau de pe plăcile de sticlă și colorate cu un colorant, Coomassie Brilliant Blue. Albastrul Coomassie se leagă puternic de toate proteinele. Vopseaua nelegată este îndepărtată prin spălarea extensivă a gelului. Benzile de proteine ​​albastre pot fi ulterior localizate și cuantificate, deoarece cantitatea de colorant legat este proporțională cu conținutul de proteine. Gelurile colorate pot fi uscate și conservate, fotografiate sau scanate cu un densitometru de înregistrare pentru a măsura intensitatea culorii din fiecare bandă proteică. Alternativ, dacă proteinele sunt radioactive, benzile proteice pot fi detectate prin autoradiografie, o tehnică care este utilizată pe scară largă în biologia celulară și moleculară modernă. Când gelurile sunt pregătite ca plăci subțiri pentru a maximiza rezoluția așa cum veți face astăzi, plăcile de acrilamidă sunt îndepărtate de pe plăcile de sticlă suport și uscate pe hârtie de filtru. O bucată de film cu raze X este plasată și strânsă strâns peste placa uscată într-o cutie rezistentă la lumină. Filmul cu raze X este expus de radioactivitatea din benzile proteice și, după dezvoltare, pe film pot fi observate pete sau benzi întunecate. Aceste benzi întunecate pot fi la rândul lor cuantificate, deoarece intensitatea lor este proporțională cu cantitatea de radioactivitate și, prin urmare, cu conținutul de proteine.


ventilația este deplasarea aerului în și din plămâni / inhalare și expirație
implică activitate musculară (respiratorie)
schimbul de gaze implică deplasarea dioxidului de carbon și a oxigenului
între alveole și sânge (în capilare) / între sânge (în capilare) și celule
respirația celulară este eliberarea de energie din molecule organice/glucoză
respirația celulară (aerobă) are loc în mitocondrii
A premia [4 max] răspunsurile trebuie să vizeze ventilația, schimbul de gaze și respirația celulară.

în timpul glicolizei glucoza este parțial oxidată în citoplasmă
(cantitate mică / randament de) ATP produs
(doi) piruvat format prin glicoliză
piruvat absorbit în/descompus în mitocondrie
necesită oxigen
se produce dioxid de carbon
se produce apa
cantitate mare / randament de energie / molecule ATP (pe moleculă de glucoză)

coliziuni între enzimă / sit activ și substrat
activitatea enzimatică crește pe măsură ce temperatura crește
coliziuni mai frecvente la temperaturi mai ridicate
fiecare enzimă are o temperatură optimă / enzimele au temperaturi optime
temperaturi ridicate (peste optime) enzime denaturate
fiecare enzimă are un pH optim / enzimele au pH optim
creșterea sau scăderea de la pH-ul optim scade rata de reacție / activitate
pH-ul extrem modifică / denaturează structura terțiară / proteină 3D / enzimă
creșterea concentrației de substrat crește viteza de reacție
o concentrație mai mare de substrat crește șansele de coliziune
până la platou
când toate site-urile active sunt ocupate
Acceptați graficul clar adnotat.


Raportul examinatorilor

  • 17N.1.SL.TZ0.09: Au fost pregătite trei baloane pentru o analiză a activității amilazei. La ora zero, fiecare dintre.
  • 17M.3.SL.TZ1.1c: Descrieți efectul temperaturii asupra activității enzimei ureazei.
  • 17M.3.SL.TZ1.1b: Un rezultat din acest experiment poate fi clasificat ca valori aberante, deoarece valoarea sa este foarte îndepărtată.
  • 17M.3.SL.TZ1.1a: Subliniați ce dezvăluie abaterile standard despre datele din acest experiment.
  • 17M.2.HL.TZ1.1f.ii: Sugerați un motiv pentru exprimarea mai mare a genei pentru transportorul de uree după un.
  • 17M.2.SL.TZ1.1c: Estimați cât de mult au fost stridiile forate mai mici crescute în apa de mare la o concentrație ridicată de CO2.
  • 17M.1.SL.TZ2.27: The bacterium Neisseria gonorrhoeae causes infections related to the human reproductive.
  • 17M.1.SL.TZ1.7: In an experiment the effect of changing pH on an enzymatic reaction is tested. Which could be.
  • 17M.1.SL.TZ1.21: Cladograms can be created by comparing DNA or protein sequences. The cladogram on the left is.
  • 17M.1.SL.TZ1.10: The graph shows the effect of increasing the substrate concentration on the rate of an.
  • 16N.3.HL.TZ0.1c: Explain what would happen to fish protein hydrolysis if no alkali were added to the reaction.
  • 16N.3.HL.TZ0.1b: Sketch on the graph the curve expected if the hydrolysis were performed using papain 0.5 %.
  • 16N.3.HL.TZ0.1a: State the effect of enzyme concentration on the hydrolysis of proteins.
  • 16N.3.SL.TZ0.2c: Explain the importance of having equal quantities of the enzyme at the start of the experiment.
  • 16N.3.SL.TZ0.2b: Suggest one method that could have been used to keep the tubes at a constant temperature.
  • 16N.3.SL.TZ0.2a: Suggest one reason for differences between the cereal grains, in the percentage of starch.
  • 16M.2.HL.TZ0.5a: Outline the action of enzymes.
  • 16N.1.HL.TZ0.9: It is possible to attach β-galactosidase to alginate beads for use in the production of.
  • 16N.1.SL.TZ0.9: A fever in a normally healthy adult during an illness is not usually a problem and can be.
  • 15M.1.HL.TZ1.9: Why does exposure to high temperatures cause an enzyme to lose its biological properties?A.
  • 15M.1.SL.TZ2.10: How can the activity of a human amylase enzyme be increased during a laboratory experiment?A.
  • 15M.2.SL.TZ1.2c: Milk contains lactose which some people can digest but some cannot. Explain the production.
  • 15M.1.HL.TZ2.11: Which is the activation energy of a reaction when it is catalysed by an enzyme?
  • 15M.2.HL.TZ1.2a (ii): Explain the production of lactose-free milk.
  • 15N.1.HL.TZ0.8: What is decreased when lactase is added to milk? A. Sweetness B. Disaccharides C.
  • 13M.2.HL.TZ2.4a: Define the active site of an enzyme.
  • 13M.2.HL.TZ2.4b: Explain how the active site promotes enzyme–substrate specificity.
  • 13M.2.HL.TZ2.4c: Outline possible effects of acids on enzyme activity.
  • 13M.1.HL.TZ1.8: Which graph shows the effect of increasing substrate concentration on enzyme activity?
  • 13M.1.HL.TZ1.9: What is produced when the enzyme lactase is added to milk? A. Glucose and galactoseB.
  • 13M.1.HL.TZ2.10: For what purpose is the enzyme lactase useful? A. Production of lactose-free milk so that.
  • 13N.1.SL.TZ0.9: In enzyme experiments, the rate of enzyme activity often gradually decreases. What is most.
  • 13M.2.SL.TZ2.5c: Explain the effect of changes of pH, substrate concentration and temperature on enzyme activity.
  • 13N.2.SL.TZ0.7b: Some proteins in membranes act as enzymes. Outline enzyme-substrate specificity.
  • 13M.1.SL.TZ2.10: What contributes to the structure of an enzyme? A. Sequence of bases linked by hydrogen.
  • 13M.3.SL.TZ2.8b: Explain the role of enzymes in metabolic pathways.
  • 11M.2.HL.TZ2.5a: Outline the effect of temperature and substrate concentration on the activity of enzymes.
  • 11M.1.SL.TZ1.8: The graph below shows the effect of substrate concentration on enzyme activity. Ce.
  • 11M.1.SL.TZ1.11: What is denaturation? A. A structural change of a protein that results in the loss of its.
  • 11M.1.SL.TZ2.30: Which variable has the least effect on enzyme activity? A. Temperature B. Light intensity.
  • 12M.1.HL.TZ1.9: Which graph shows the effect of increasing the substrate concentration on enzyme activity?
  • 12M.1.SL.TZ2.10: How does an increase in temperature affect enzyme activity?
  • 09M.2.HL.TZ1.6c: Outline how enzymes catalyse reactions.
  • 09M.2.SL.TZ1.3b: Explain enzyme-substrate specificity.
  • 09M.2.SL.TZ1.3a: Define active site.
  • 09M.2.SL.TZ2.3b: Explain the effects of pH on enzyme catalysed reactions.
  • 09M.1.HL.TZ2.34: Which of the following statements is true about enzymes? A. They are used up in the.
  • 09M.1.SL.TZ1.11: What happens as an enzyme becomes denatured? A. The enzyme works faster. B. The enzyme works.
  • 10M.2.HL.TZ1.2d: Simple laboratory experiments show that when the enzyme lactase is mixed with lactose, the.
  • 10M.2.SL.TZ1.2d: Simple laboratory experiments show that when the enzyme lactase is mixed with lactose, the.
  • 10M.2.SL.TZ2.5a: Outline the role of hydrolysis in the relationships between monosaccharides, disaccharides.
  • 10M.2.SL.TZ2.5b: Describe the use of biotechnology in the production of lactose-free milk.
  • 10M.2.SL.TZ2.5c: Explain the importance of enzymes to human digestion.
  • 11N.2.HL.TZ0.5 b: Many people cannot digest lactose and benefit from a diet containing no lactose. Outline the.
  • 11N.2.SL.TZ0.7c: Respiration and other processes in cells involve enzymes. Explain the factors that can affect.
  • 12N.2.SL.TZ0.5b: Metabolic reactions are catalysed by enzymes. Explain how enzymes catalyse reactions and how.

Mulțumiri

This work was supported in part by grants (No. 30230100 and No. 30670420) from the Natural Science Foundation of China.

We are very grateful to Professor J. F. Wang from the Institute of Biophysics, Chinese Academy of Sciences, and Professor L. Huang from the Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, for kindly providing the Ssh10b gene. We also express our sincere thanks to Dr. Sarah Perrett of the Institute of Biophysics, Chinese Academy of Sciences, for comments on this manuscript.


Microcentrifuges

Compact, safe and easy-to-use microcentrifuges combine power with versatility and convenience. Acestea microcentrifuges can support all your micro volume protocols—including nucleic acid minipreps, spin columns, PCR tubes and strips, and hematocrit capillaries—in a small footprint.


Priveste filmarea: Desnaturação de proteínas (Ianuarie 2022).