Informație

Există o bază de date, un instrument sau o metodă pe care să o pot folosi pentru a afla care dintre genele mele codifică receptorii de citokine?


Am o listă de peste 600 de gene exprimate diferențial din analizele mele de date ARN seq. Vreau să continui să aflu care dintre genele mele codifică receptorii de citokine, astfel încât să pot arăta pe o hartă termică modul în care expresia lor variază între grupuri. Poate cineva să-mi dea un indiciu cu privire la instrumentul sau metoda pe care o pot folosi pentru a afla care dintre codurile mele de gene pentru receptorii de citokine?

Mulțumesc anticipat.


Sunt sigur că există multe modalități de a proceda în acest sens (inclusiv cercetarea literaturii prin PubMed), dar, pentru început, am căutat în baza de date de termeni GO, care, pentru termenul de căutare „activitate a receptorului de citokine”, a returnat acest lucru, care include un număr de gene pe care le pot descărca ca fișier Excel și le pot potrivi cu setul meu de gene folosind R.


LIQA: cuantificare și analiză cu izoforme citite pe termen lung

Tehnologiile de secvențiere a ARN-ului cu citire lungă (ARN-seq) pot secvența transcripții de lungime completă, facilitând explorarea expresiei genei specifice izoformei peste ARN-seq cu citire scurtă. Prezentăm LIQA pentru a cuantifica expresia izoformei și a detecta evenimente de splicing alternativ diferențial (DAS) folosind secvențierea directă a ARNm direct sau date de secvențiere ADNc. LIQA încorporează scorul de calitate al perechii de bază și informații despre lungimea citirii specifice izoformei într-un model de supraviețuire pentru a atribui diferite ponderi între citiri și utilizează un algoritm de maximizare a așteptărilor pentru estimarea parametrilor. Aplicăm LIQA datelor ARN-seq citite îndelungat de la Universal Human Reference, leucemie mieloidă acută și celule epiteliale scuamoase esofagiene și demonstrăm acuratețea sa ridicată în profilarea evenimentelor alternative de îmbinare.


Există o bază de date, un instrument sau o metodă pe care să o pot folosi pentru a afla care dintre genele mele codifică receptorii de citokine? - Biologie

O bază de date care furnizează informații despre structura genomurilor asamblate, nume de ansamblu și alte metadate, rapoarte statistice și link-uri către datele secvenței genomice.

Un set organizat de metadate pentru colecții de cultură, muzee, herbari și alte colecții de istorie naturală. Înregistrările afișează coduri de colecție, informații despre instituțiile de origine ale colecțiilor și linkuri către date relevante la NCBI.

O colecție de studii de genomică, genomică funcțională și genetică și link-uri către seturile de date rezultate. Această resursă descrie domeniul de aplicare, materialul și obiectivele proiectului și oferă un mecanism de recuperare a seturilor de date care sunt adesea dificil de găsit din cauza adnotării inconsistente, a mai multor trimiteri independente și a naturii variate a diverselor tipuri de date care sunt adesea stocate în baze de date diferite.

Baza de date BioSample conține descrieri ale surselor biologice utilizate în testele experimentale.

Un efort de colaborare pentru identificarea unui set de bază de regiuni de codificare a proteinelor umane și de șoarece care sunt adnotate în mod constant și de înaltă calitate.

Include variații de nucleotide unice, microsateliți și inserții și deleții la scară mică. dbSNP conține frecvență specifică populației și date despre genotip, condiții experimentale, context molecular și informații de cartografiere atât pentru variații neutre, cât și pentru mutații clinice.

Baza de date a secvențelor genetice NIH, o colecție adnotată a tuturor secvențelor de ADN disponibile publicului. GenBank face parte din Colaborarea internațională a bazei de date cu secvențe de nucleotide, care cuprinde DNA DataBank din Japonia (DDBJ), Laboratorul European de Biologie Moleculară (EMBL) și GenBank la NCBI. Aceste trei organizații fac schimb zilnic de date. GenBank este format din mai multe divizii, dintre care majoritatea pot fi accesate prin baza de date Nucleotide. Excepțiile sunt diviziunile EST și GSS, care sunt accesate prin bazele de date Nucleotide EST și respectiv Nucleotide GSS.

O compilație de date din NIAID Influenza Genome Sequencing Project și GenBank. Acesta oferă instrumente pentru analiza secvenței gripale, adnotări și depunere către GenBank. Această resursă are, de asemenea, legături către alte resurse de secvență gripală și publicații și informații generale despre virusurile gripale.

Un proiect care implică colectarea și analiza secvențelor genomice ale agentului patogen bacterian provenind din alimente, mediul și izolatele pacienților. În prezent, o conductă automată grupează și identifică secvențe furnizate în primul rând de laboratoare de sănătate publică pentru a ajuta la investigarea focarelor de boli de origine alimentară și pentru a descoperi surse potențiale de contaminare a alimentelor.

O colecție de secvențe de nucleotide din mai multe surse, inclusiv GenBank, RefSeq, baza de date Third Party Annotation (TPA) și PDB. Căutarea în baza de date nucleotidă va produce rezultatele disponibile din fiecare dintre bazele sale de date componente.

Baza de date a secvențelor de ADN conexe care provin din studii comparative: filogenetic, populațional, de mediu și, într-un grad mai mic, mutațional. Fiecare înregistrare din baza de date este un set de secvențe ADN. De exemplu, un set de populație oferă informații despre variația genetică a unui organism, în timp ce un set filogenetic poate conține secvențe și alinierea lor, a unei singure gene obținute de la mai multe organisme înrudite.

Un registru public al reactivilor de acid nucleic proiectat pentru utilizare într-o mare varietate de aplicații de cercetare biomedicală, împreună cu informații despre distribuitorii de reactivi, eficacitatea sondei și similitudinile secvenței calculate.

RefSeqGene O colecție de secvențe genomice de referință specifice genei umane. Gena RefSeq este un subset al bazei de date RefSeq a NCBI și este definită pe baza revizuirii de la curatorii bazelor de date specifice locusului și a comunității de testare genetică. Ele formează o bază stabilă pentru raportarea mutațiilor, pentru stabilirea convențiilor consistente de numerotare a intronilor și exonilor și pentru definirea coordonatelor altor variații semnificative biologic. RefSeqGene face parte din colaborarea Locus Reference Genomic (LRG). Secvență de referință (RefSeq)

O colecție de ADN genomic curatat, non-redundant, transcript (ARN) și secvențe de proteine ​​produse de NCBI. RefSeqs oferă o referință stabilă pentru adnotarea genomului, identificarea și caracterizarea genei, mutația și analiza polimorfismului, studiile de expresie și analizele comparative. Colecția RefSeq este accesată prin bazele de date Nucleotide și Protein.

Sequence Read Archive (SRA) stochează date de secvențiere de la următoarea generație de platforme de secvențiere, inclusiv Roche 454 GS System®, Illumina Genome Analyzer®, Life Technologies AB SOLiD System®, Helicos Biosciences Heliscope®, Complete Genomics® și Pacific Biosciences SMRT® .

O bază de date care conține secvențe construite din datele secvenței primare existente în GenBank. Secvențele și adnotările corespunzătoare sunt susținute experimental și au fost publicate într-o revistă științifică evaluată de colegi. Înregistrările TPA sunt recuperate prin baza de date nucleotidică.

Un depozit de cromatograme de secvențe ADN (urme), apeluri de bază și estimări de calitate pentru citiri cu o singură trecere din diferite proiecte de secvențiere la scară largă.

Descărcări

Executabilele BLAST pentru uz local sunt furnizate pentru sistemele Solaris, LINUX, Windows și MacOSX. Consultați fișierul README din directorul ftp pentru mai multe informații. Bazele de date preformatate pentru nucleotide, proteine ​​și căutări traduse BLAST sunt, de asemenea, disponibile pentru descărcare în subdirectorul db.

Baze de date secvențiale pentru utilizare cu programele BLAST independente. Fișierele din acest director sunt baze de date pre-formatate care sunt gata de utilizare cu BLAST.

Baze de date secvențiale în format FASTA pentru utilizare cu programele BLAST de sine stătătoare. Aceste baze de date trebuie să fie formatate folosind formatdb înainte de a putea fi utilizate cu BLAST.

Acest site conține fișiere pentru toate înregistrările de secvență din GenBank în formatul implicit de fișier plat. Fișierele sunt organizate de divizia GenBank, iar conținutul complet este descris în fișierul README.genbank.

Acest site conține toate înregistrările de secvențe de nucleotide și proteine ​​din colecția secvenței de referință (RefSeq). Directorul „„ eliberare ”„ conține cea mai recentă versiune a colecției complete, în timp ce datele pentru organismele selectate (cum ar fi omul, șoarecele și șobolanul) sunt disponibile în directoare separate. Datele sunt disponibile în format FASTA și fișier plat. Consultați fișierul README pentru detalii.

Acest site conține date de secvențiere de ultimă generație organizate de proiectul de secvențiere trimis.

Acest site conține datele cromatogramelor de urmărire organizate pe specii. Datele includ cromatograma, scorurile de calitate, secvențele FASTA din apelurile automate de bază și alte informații auxiliare în text delimitat de tabulatori, precum și în formate XML. Consultați fișierul README pentru detalii.

Acest site conține bazele de date UniVec și UniVec_Core în format FASTA. Consultați fișierul README.uv pentru detalii.

Acest site conține date despre secvența genomului întreg organizate prin codul de proiect din 4 cifre. Datele includ fișiere plate GenBank și GenPept, scoruri de calitate și statistici rezumate. Consultați fișierul README.genbank.wgs pentru mai multe informații.

Trimiteri

Un formular online care oferă o interfață pentru cercetători, consorții și organizații pentru a-și înregistra BioProiectele. Acesta servește drept punct de plecare pentru prezentarea datelor genomice și genetice pentru studiu. Datele nu trebuie transmise în momentul înregistrării BioProject.

Un instrument de trimitere de secvențe bazat pe web pentru una sau câteva trimiteri la baza de date GenBank, conceput pentru a face procesul de depunere rapid și ușor.

Instrument pentru trimiterea în baza de date GenBank a secvențelor de nucleotide scurte de coduri de bare dintr-un locus genetic standard pentru utilizare în identificarea speciilor.

Un instrument software autonom dezvoltat de NCBI pentru trimiterea și actualizarea intrărilor în bazele de date publice de secvențe (GenBank, EMBL sau DDBJ). Este capabil să gestioneze depuneri simple care conțin o singură secvență scurtă de ARNm, depuneri complexe care conțin secvențe lungi, adnotări multiple, seturi segmentate de ADN, precum și secvențe din studii filogenetice și de populație cu alinieri. Pentru o trimitere simplă, utilizați în schimb instrumentul de trimitere online BankIt.

Un program de linie de comandă care automatizează crearea de înregistrări de secvență pentru trimiterea către GenBank folosind multe dintre aceleași funcții ca Sequin. Este utilizat în principal pentru transmiterea genomurilor complete și a loturi mari de secvențe.

Această legătură descrie modul în care expeditorii de date SRA pot obține un site FTP NCBI sigur pentru datele lor și descrie, de asemenea, formatele de date permise și structurile de directoare.

Un punct de intrare unic pentru trimiterea de informații pentru a le trimite și a găsi informații despre toate procesele de transmitere a datelor la NCBI. În prezent, acesta servește ca interfață pentru înregistrarea BioProjects și BioSamples și transmiterea datelor pentru WGS și GTR. Viitoarele adăugiri la acest site sunt planificate.

Acest link descrie modul în care expeditorii de date de urmărire pot obține un site FTP NCBI sigur pentru datele lor și descrie, de asemenea, formatele de date permise și structurile de directoare.

Instrumente

Găsește regiuni de similaritate locală între secvențe biologice. Programul compară secvențele de nucleotide sau proteine ​​cu bazele de date ale secvențelor și calculează semnificația statistică a meciurilor. BLAST poate fi utilizat pentru a deduce relații funcționale și evolutive între secvențe, precum și pentru a ajuta la identificarea membrilor familiilor genetice.

Vă permite să preluați înregistrări din mai multe baze de date Entrez încărcând un fișier de GI sau numere de acces din bazele de date Nucleotide sau Protein sau un fișier cu identificatori unici din alte baze de date Entrez. Rezultatele căutării pot fi salvate în diferite formate direct într-un fișier local de pe computer.

Instrumente care oferă acces la date din sistemul Entrez al NCBI în afara interfeței obișnuite de interogare web. Acestea oferă o metodă de automatizare a sarcinilor Entrez în cadrul aplicațiilor software. Fiecare utilitar efectuează o sarcină de recuperare specializată și poate fi utilizat pur și simplu scriind un URL formatat special.

Acest instrument compară secvențele de nucleotide sau proteine ​​cu bazele de date de secvențe genomice și calculează semnificația statistică a potrivirilor utilizând algoritmul BLAST (Basic Local Alignment Search Tool).

Instrumentul NCAP Remap permite utilizatorilor să proiecteze date de adnotare și să convertească locațiile caracteristicilor dintr-un ansamblu genomic în altul sau în secvențe RefSeqGene printr-o analiză bazată pe bază. Sunt oferite opțiuni pentru a regla stringența remapării, iar rezultatele rezumate sunt afișate pe pagina web. Rezultatele complete pot fi descărcate pentru vizualizare în vizualizatorul grafic al NCBI Genome Workbench, iar datele de adnotări pentru caracteristicile remapate, precum și datele rezumate sunt, de asemenea, disponibile pentru descărcare.

O aplicație integrată pentru vizualizarea și analiza datelor secvenței. Cu Genome Workbench, puteți vizualiza datele din bazele de date de secvențe disponibile public la NCBI și puteți combina aceste date cu propriile date.

Un instrument de analiză grafică care găsește toate cadrele de citire deschise în secvența unui utilizator sau într-o secvență deja în baza de date. Pot fi utilizate șaisprezece coduri genetice diferite. Secvența de aminoacizi dedusă poate fi salvată în diferite formate și căutată în baza de date proteică utilizând BLAST.

Instrumentul Primer-BLAST folosește Primer3 pentru a proiecta primerii PCR într-un șablon de secvență. Produsele potențiale sunt apoi analizate automat cu o căutare BLAST în baza de date specificată de utilizator, pentru a verifica specificitatea țintei intenționate.

Un utilitar pentru calcularea alinierii proteinelor la secvența de nucleotide genomice. Se bazează pe o variație a algoritmului global de aliniere Needleman Wunsch și explică în mod specific intronii și semnalele de îmbinare. Datorită acestui algoritm, ProSplign este precis în determinarea locurilor de îmbinare și toleranță la erorile de secvențiere.

Oferă o afișare grafică configurabilă a unei secvențe de nucleotide sau proteine ​​și a caracteristicilor care au fost adnotate pe acea secvență. În plus față de utilizarea pe paginile bazei de date cu secvențe NCBI, acest vizualizator este disponibil ca o componentă de pagină web încorporabilă. Documentația detaliată, inclusiv un ghid de referință API, este disponibilă pentru dezvoltatorii care doresc să încorporeze vizualizatorul în propriile pagini.

Un utilitar pentru calcularea alinierii secvenței cADN la genomic. Se bazează pe o variație a algoritmului global de aliniere Needleman-Wunsch și explică în mod specific intronii și semnalele de îmbinare. Datorită acestui algoritm, Splign este precis în determinarea locurilor de îmbinare și toleranță la erorile de secvențiere.

Un sistem pentru identificarea rapidă a segmentelor unei secvențe de acid nucleic care poate fi de origine vectorială. VecScreen caută o secvență de interogare pentru segmente care se potrivesc cu orice secvență dintr-o bază de date vectorială specializată non-redundantă (UniVec).


PROCESUL DE STUDIU

Comitetul a ținut o întâlnire inițială de organizare în ianuarie 2001. CDC și NIH au prezentat sarcina comitetului la reuniune, iar comitetul a efectuat apoi o revizuire generală a preocupărilor privind siguranța imunizării. La această ședință, comitetul a stabilit, de asemenea, metodologia de bază care trebuie utilizată pentru evaluarea cauzalității în ipotezele care urmează să fie luate în considerare în deliberările sale ulterioare. Un site web (www.iom.edu/imsafety) și un listserv au fost create pentru a oferi acces publicului la informații despre activitatea comitetului și pentru a facilita comunicarea cu comitetul. Concluziile și recomandările rapoartelor comisiei de până acum (a se vedea caseta 1) sunt rezumate în anexa A.

CUTIE 1

Rapoarte anterioare ale Comitetului de revizuire a siguranței imunizării. Evaluarea siguranței imunizării: vaccin împotriva rujeolei-oreionului-rubeolei și autism (IOM, 2001a) Revizuirea siguranței imunizării: vaccinuri care conțin timerosal și tulburări ale neurodezvoltării (IOM, 2001b)

Pentru evaluarea întrebărilor referitoare la vaccinuri și autism, comitetul a ținut o ședință științifică deschisă în februarie 2004 pentru a asculta prezentări cu privire la problemele care țin de subiect (vezi anexa B). Multe dintre aceste prezentări sunt disponibile în format electronic (fișiere audio și diapozitive) pe site-ul web al proiectului. În plus, comitetul a analizat o colecție extinsă de materiale, în principal din literatura științifică și medicală publicată, evaluată de colegi. Comitetul a comandat, de asemenea, o lucrare despre autism și sistemul imunitar. O listă a materialelor examinate de comitet, inclusiv multe elemente care nu sunt citate în acest raport, poate fi găsită pe site-ul web al proiectului.


Mulțumiri

Mulțumiri speciale Leander Dony, care a depanat, actualizat și testat studiul de caz pentru a lucra cu cele mai recente metode. Mai mult, dorim să mulțumim multor oameni care au corectat caietul de studii de caz și manuscrisul și l-au îmbunătățit cu comentariile și expertiza lor. Pentru aceasta, recunoaștem contribuția lui Maren Buttner, David Fischer, Alex Wolf, Lukas Simon, Luis Ospina-Forero, Sophie Tritschler, Niklas Koehler, Goekcen Eraslan, Benjamin Schubert, Meromit Singer, Dana Pe'er și Rahul Satija. Mulțumiri speciale pentru aceasta și recenzenților anonimi ai manuscrisului și editorului, Thomas Lemberger, pentru comentariile lor amănunțite, constructive și extinse. Caietul de studiu de caz a fost testat și îmbunătățit de primii adoptatori Marius Lange, Hananeh Aliee, Subarna Palit și Lisa Thiergart. Volker Bergen și Alex Wolf au contribuit, de asemenea, la fluxul de lucru, făcând adaptări scanpy. Alegerea setului de date pentru a arăta în mod optim toate aspectele fluxului de lucru de analiză a fost facilitată de contribuția amabilă a lui Adam Haber și Aviv Regev. Această lucrare a fost susținută de grantul BMBF # 01IS18036A și grantul # 01IS18053A, de către Fundația Germană de Cercetare (DFG) din cadrul Centrului de cercetare colaborativă 1243, subproiectul A17, de către Asociația Helmholtz (subvenția incubatorului sparse2big, subvenția nr. ZT-I-0007) și de Chan Zuckerberg Initiative DAF (fond consultat al Silicon Valley Community Foundation, 182835).


Toate codurile de analiză prezentate în acest manuscris pot fi găsite la http://oshlacklab.com/methyl-geneset-testing/. Site-ul web de analiză a fost creat folosind fluxul de lucru (1.6.2) Pachetul R [38]. Depozitul GitHub asociat site-ului de analiză este la: https://github.com/Oshlack/methyl-geneset-testing.

Model statistic pentru GOmeth

Testul statistic pentru GOmeth și GOregion se bazează pe distribuția hipergeometrică noncentrală a lui Wallenius, care este o versiune generalizată a distribuției hipergeometrice în care elementele sunt eșantionate cu părtinire. Pentru GOmeth, luăm următoarea procedură în pas:

Pentru fiecare CpG i adnotată la genă j, calculați o greutate

Dacă fiecare CpG este adnotat la exact o genă, atunci wij = 1.

Lăsa i = 1, ..., euj denotă CpG-urile adnotate la genă j. Calculați numărul echivalent de CpG măsurate pe genă j la fel de:

Dacă nu există CpG asociate cu mai multe gene, atunci Nj este pur și simplu numărul de sonde măsurate pe gene j.

Lăsa A definiți setul de Cpg semnificativ diferențiat metilat. Pentru fiecare genă j, definiți un vector indicator 1j(X) de lungime Euj astfel încât Xi = 1 dacă CpGijA, și Xi = 0 dacă CpGijA, Unde i = 1,…,Ij.

Lăsa wj definiți vectorul greutăților wij pentru fiecare genă j. Calculați scorul diferențial de metilare pentru fiecare genă j

Rețineți valoarea maximă a Sj este 1 și Sj & lt 1 numai în cazurile în care CpG-urile semnificative sunt asociate cu mai multe gene și greutățile însumate sunt mai mici decât una. Sj = 0 atunci când nu există CpGs metilate semnificativ diferențiat între gene j.

Lăsa j = 1, …, Jg denotă genele care sunt prezente în setul de gene g. Calculați statistica de îmbogățire pentru testul hipergeometric noncentral al lui Wallenius pentru fiecare set de gene g

Pentru testul hipergeometric noncentral al lui Wallenius standard, statistica de îmbogățire este intersecția dintre genele semnificativ diferențiate metilate și genele din setul de gene g, care ignoră CpG asociate cu mai multe gene. Statistica noastră de îmbogățire modificată ESg ține cont de CpG asociate cu mai multe gene pentru setul de gene g.

Calculați funcția de ponderare a probabilității (PWF) prin aplicarea unei linii medii mobile la un vector binar ordonat (pe baza numărului de CpG asociate) în care 1 indică faptul că o genă este metilată diferențial și 0 indică faptul că gena nu este metilată diferențial. Folosim funcția „tricubeMovingAverage” în lima pachet care este similar cu o curbă loess de cel puțin pătrate de grad zero. Vectorul binar este ordonat după numărul de CpG echivalente care măsoară metilarea fiecărei gene, Nj, de la cel mai mic la cel mai mare. Ieșirea este un vector de aceeași lungime cu intrarea, astfel încât fiecărei gene i se atribuie o probabilitate de metilare diferențială pe baza valorii netezite. Apoi calculăm șansele de îmbogățire așteptate pentru fiecare set de gene g calculând PWF mediu al genelor din set și comparându-l cu PWF mediu al restului de gene reprezentate pe matrice.

Pentru testarea îmbogățirii fiecărui set de gene g, obținem o valoare p unilaterală din distribuția hipergeometrică noncentrală a lui Wallenius cu următorii parametri: X = podea(ESg), m1 = mărimea setului de gene Jg, m2 = numărul de gene din restul matricei, n = numărul total de gene semnificative și cote = ODDSg. Noi folosim BiasedUrn Pachet R pentru a obține valori p.

Simulări nule: eșantionare aleatorie a CpGs

Am selectat aleatoriu seturi de 50, 100, 500, 1000, 5000 și 10.000 CpGs din adnotarea matricei Illumina atât pentru matrice de 450k, cât și pentru matrice EPIC. Eșantionarea a fost repetată de 100 de ori pentru fiecare dimensiune a setului CpG. Am testat pentru îmbogățirea semnificativă a categoriilor GO utilizând un test hipergeometric standard (HGT), un test hipergeometric al lui Wallenius care ține cont de distorsiunea numărului sondei (HGT-mod) și GOmeth, care se bazează pe testul hipergeometric al lui Wallenius și ține cont de numărul de sondă și multi -parțialitate genică.

Seturi de date de metilare

Eșantioanele normale din setul de date KIRC TCGA [39] au fost utilizate pentru estimarea ratei de descoperire falsă a diferitelor metode de testare a setului de gene. Datele au fost descărcate folosind curatedTCGAData Pachetul de bioconductori [40] și cele 160 de probe normale extrase. Datele au fost furnizate ca fiind deja procesate β cu toate acestea, am efectuat filtrarea suplimentară și am eliminat sondele de calitate slabă, sondele care conțin SNP-uri, precum și sondele cu cromozomi sexuali. Graficele de scalare multidimennaționale rezultate nu au prezentat dovezi aparente de sex sau alte efecte tehnice (Fig. 3C).

În plus, 85 de probe normale din setul de date BRCA TCGA [41] au fost utilizate pentru a estima ratele de descoperire falsă a celor șapte metode de testare a setului de gene. Datele au fost descărcate folosind curatedTCGAData Pachetul bioconductor și cele 97 de probe normale extrase. În urma controlului calității, au fost îndepărtate 12 eșantioane (8 cu distribuții neobișnuite ale valorii beta și 4 mostre afro-americane). Sondele de calitate slabă și sondele care conțin SNP au fost filtrate. Sondele localizate pe cromozomii sexuali au fost reținute deoarece toate probele au fost de sex feminin (Fișier suplimentar 1: Fig. S3C).

Pentru a compara performanța între diferite metode de testare a setului de gene atunci când există o metilare diferențială semnificativă, am folosit datele Illumina Infinium HumanMethylationEPIC (GSE110554) generate de neutrofile sortate în flux (Neu, n = 6), monocite (Mono, n = 6), B -limfocite (celule B, n = 6), celule T CD4 + (CD4T, n = 7, șase probe și o replică tehnică), celule T CD8 + (CD8T, n = 6), celule ucigașe naturale (NK, n = 6) și 12 amestecuri artificiale de ADN (etichetate ca MIX) [29]. Numai celulele sortate au fost utilizate în analiza noastră. Datele au fost descărcate folosind ExperimentHub Pachet bioconductor.

De asemenea, am analizat un set de date cu celule B în curs de dezvoltare care corespundea măsurătorilor ADN metilării și expresiei genelor [42]. Patru populații de stadii timpurii de dezvoltare a celulelor B au fost obținute din măduva osoasă fetală umană, de la 8 indivizi. Metilarea a fost măsurată folosind Illumina HumanMethylation450 Beadchip, iar expresia genei a fost măsurată folosind GeneChip Human Gene 1.0 ST Array (Affymetrix). Cele patru populații au fost identificate folosind anticorpi de citometrie în flux și constau din Stadiul 1 (predominant progenitori multipotenți și progenitori limfoizi comuni), Stadiul 2 (celule pre-BI), Stadiul 3 (celule pre-B-II) și Stadiul 4 (celule B imature ). Datele au fost descărcate de pe Genn Expression Omnibus (GSE45461).

Analiză și prelucrare

Majoritatea analizelor au fost efectuate folosind R (4.0.3), iar unele folosind R (3.6.1) [43]. Versiunile specifice R și pachetele utilizate pentru diferite aspecte ale analizei pot fi vizualizate în secțiunile „Informații despre sesiune” ale site-ului web de analiză asociat cu acest studiu: http://oshlacklab.com/methyl-geneset-testing/.

Controlul calității și normalizarea

Toate datele de metilare au fost prelucrate folosind minfi [3, 44] Pachet R Bioconductor [45, 46]. Între matrice și normalizare de tip sondă s-a efectuat folosind metoda de normalizare cuantică stratificată (SQN) [47]. Sondele cu o valoare P de detectare & gt 0,01 într-una sau mai multe probe au fost aruncate. Sondele potențial afectate de SNP-urile comune (frecvența alelelor minore > 0) proximale de CpG de interes (până la 2 bp în amonte și 1 în aval) și sondele nespecifice [37, 48] au fost, de asemenea, eliminate din analize ulterioare.

Analize statistice

Proporția de metilare la fiecare CpG este reprezentată de βvaloare, definită ca proporție dintre semnalul metilat și semnalul total și calculată din valorile intensității normalizate. Analizele statistice au fost efectuate pe M valori ( left [M = frac right] ) conform recomandărilor lui Du și colab. [49].

Compararea metodelor de testare a setului de gene folosind date sortate de celule sanguine

Modelele liniare CpG în funcție de sondă au fost montate pentru a determina diferențele de metilare între tipurile de celule (celule B vs NK, CD4 vs CD8 celule T, monocite vs neutrofile) folosind limma pachet [2]. Sonde metilate diferențial (DMP) au fost identificate utilizând teste empirice Bayes moderat t [50], efectuând contracție empirică robustă Bayes a variațiilor genetice pentru a proteja împotriva sondelor hipervariabile [51]. Valorile empirice Bayes moderat-t p au fost apoi calculate în raport cu un prag minim semnificativ log-fold-change (lfc) pe scara valorii M (lfc = 0,5, corespunzător |Δβ|

0,1) [30]. Valorile P au fost ajustate pentru mai multe teste folosind procedura Benjamini-Hochberg [52].

Pentru fiecare comparație, am testat pentru îmbogățirea semnificativă a categoriilor GO și a căilor KEGG. Am testat seturi cu cel puțin 5 gene și cel mult 5000 de gene pentru metilGSA metode. Primul clasat pe 5000 CpGs a fost testat folosind HGT și GOmeth, de la misMethyl pachet, pentru îmbogățirea termenilor GO și a căilor KEGG. Valorile brute p au fost transmise ca intrare la metilGSA metode. Metodele ebGSEA au fost executate folosind ebGSEA Pachetul R (https://github.com/aet21/ebGSEA).

Comparația metodelor de testare a setului de gene folosind date despre carcinomul cu celule limpezi la rinichi (KIRC)

Datele KIRC [39] din curatedTCGAData pachetul a fost furnizat ca β valorile cu puncte de date mascate punctele de date au fost mascate ca „NA” dacă valoarea lor p de detectare a fost mai mare de 0,05 sau sonda a fost adnotată ca având un SNP în 10 perechi de baze sau se repetă în 15 perechi de baze ale CpG interogat [53]. Am extras doar cele 160 de probe normale și am eliminat sondele cu orice valori NA, precum și sondele afectate de SNP și sondele multi-cartografiere și cromozomul sexual, așa cum s-a descris anterior. Acest lucru a lăsat 364.602 de sonde pentru analiză în aval.

Am efectuat 100 de simulări nule prin eșantionarea aleatorie a probelor normale și împărțirea lor în două „grupuri” artificiale cu 5, 10, 20, 40 și 80 de probe pe grup. Pentru fiecare dintre cele 100 de simulări, la fiecare dimensiune a eșantionului, au fost identificate DMP-uri între grupuri utilizând teste empirice Bayes t moderate [50], efectuând o contracție empirică robustă Bayes a variațiilor genetice pentru a proteja împotriva sondelor hipervariabile [51].

Am efectuat apoi testarea setului de gene a rezultatelor analizei diferențiale a metilării folosind mai multe metode cu seturile genetice Broad MSigDB disponibile în Campion Pachet de bioconductori. GOmeth a fost rulat folosind atât primele 1000, cât și primele 5000 CpG semnificative ca intrare. The metilGSA metodele mGLM, mRRA (ORA) și mRRA (GSEA) au fost efectuate cu dimensiuni de set de gene limitate la minimum 5 și maximum 5000 de gene. Metoda ebGSEA a fost rulată folosind parametrii impliciti și au fost comparate atât rezultatul KPMT, cât și WT.

Compararea metodelor de testare a setului de gene folosind date despre carcinomul mamar invaziv (BRCA).

Ca și în cazul datelor KIRC, datele BRCA [41] au fost descărcate folosind curatedTCGAData pachet. Apoi am extras cele 97 de probe normale și am îndepărtat sondele cu orice valoare NA, precum și sondele afectate de SNP și sondele cu cartografiere multiplă, așa cum s-a descris anterior. Sondele cromozomiale sexuale au fost reținute, deoarece toți donatorii de probe au fost de sex feminin. Acest lucru a lăsat 371.389 de sonde pentru analize suplimentare. Au fost îndepărtate douăsprezece eșantioane periferice (8 cu distribuții neobișnuite de valori beta și 4 eșantioane afro-americane), lăsând 85 de eșantioane pentru analiza în aval.

Am efectuat 100 de simulări nule prin submostrarea aleatorie a probelor normale și împărțirea lor în două grupuri artificiale cu 5, 10, 20 și 40 de probe pe grup. DMP-urile dintre cele două grupuri au fost identificate așa cum este descris pentru datele KIRC, urmate de aceeași abordare de testare a setului de gene folosind cele șapte metode diferite prezentate anterior.

Date și analiză ARN-Seq

Datele ARN-Seq pentru tipurile de celule sanguine sortate au fost descărcate de pe SRA (GSE107011 SRP125125) [31, 32]. Citirile au fost mapate la transcriptomul de referință hg19 (http://refgenomes.databio.org/v2/asset/hg19_cdna/fasta/archive?tag=default) și cuantificate folosind Salmon (1.2.1) [54]. Estimările la nivel de transcripție a somonului au fost importate și sintetizate la nivelul genei ca TPM la scară lungă folosind tximport Pachet de bioconductori [55]. Genele slab exprimate au fost filtrate folosind edgeR [56] Funcția „filterByExpr” descrisă de Chen la al [57] .. Datele au fost apoi TMM normalizate [58] și transformate folosind „voomWithQualityWeights” [59], pentru a crește puterea prin combinarea „voom” [60] observațional- greutăți de nivel cu greutăți specifice eșantionului.

Modelele liniare la nivel de sondă au fost apoi adaptate pentru fiecare genă pentru a determina diferențele de expresie a genei între tipurile de celule (celule B vs celule NK, CD4 vs CD8 celule T, monocite vs neutrofile) folosind limma [2]. Genele exprimate diferențial au fost identificate utilizând teste empirice Bayes moderate t [50], efectuând o contracție Bayes empirică robustă a variațiilor genice pentru a proteja împotriva sondelor hipervariabile [51]. Valorile P au fost ajustate pentru mai multe teste folosind procedura Benjamini-Hochberg [52].

Am folosit funcția goana din limma pachet pentru a testa îmbogățirea categoriilor GO, kegga pentru a testa pentru îmbogățirea căilor KEGG și o versiune generalizată a goana și kegga pentru a testa pentru îmbogățirea seturilor genetice Broad MSigDB. Toate metodele au luat în considerare prejudecata lungimii genelor [23]. Seturile de adevăr GO, KEGG și MSigDB au fost apoi definite pentru fiecare comparație de tip celular din analiza ARN-Seq ca primele 100 de seturi îmbogățite.

Date și analiză privind expresia genei matricei Affymetrix

Datele privind expresia genei Affymetrix Human Gene 1.0 ST Array pentru dezvoltarea celulelor pre-B au fost descărcate de la GEO (GSE45460) [42].

Fișierele CEL brute au fost încărcate și procesate folosind oligo Pachet de bioconductori. Datele au fost corectate de fond, normalizate și sintetizate folosind pre-procesarea Robust Multichip Average (RMA) [33, 34]. Au fost reținute doar sonde cu o intensitate medie mai mare de 4,5, în cel puțin 7 probe. Identificatorii de grup de transcriere care s-au mapat la mai mulți identificatori Entrez au fost filtrați, împreună cu orice sonde care nu s-au mapat la identificatorii Entrez, lăsând 19.494 de gene pentru analiza în aval.

S-au montat apoi modele liniare sonde pentru fiecare genă pentru a determina diferențele de expresie genică între stadiul 1 și stadiul 2 al dezvoltării celulelor pre B (stadiul 1 vs stadiul 2) folosind limma [2]. Genele exprimate diferențial au fost identificate utilizând teste empirice Bayes moderate t [50], efectuând o contracție Bayes empirică robustă a variațiilor genice pentru a proteja împotriva sondelor hipervariabile [51]. Valorile p au fost ajustate pentru teste multiple folosind procedura Benjamini-Hochberg [52]. Gene cu jurnal2 schimbarea de ori mai mare de 0,5 folosind TREAT [30] și FDR mai mică de 0,05 au fost considerate a fi exprimate diferențial.

Funcția goana din limma pachetul a fost folosit pentru a testa îmbogățirea categoriilor GO și kegga pentru a testa îmbogățirea căilor KEGG. Seturile de adevăr GO și KEGG au fost apoi definite pentru comparația Stadiul 1 versus Stadiul 2 din analiza expresiei genice ca primele 100 de seturi îmbogățite.

Evaluarea GOregion folosind date de celule sanguine sortate în flux

Datele lllumina Infinium HumanMethylationEPIC (GSE110554) generate de celulele sanguine sortate în flux au fost utilizate pentru identificarea DMR. Datele au fost prelucrate așa cum s-a descris anterior. DMR între tipurile de celule (celule B vs celule NK, CD4 vs CD8 celule T, monocite vs neutrofile) au fost identificate folosind DMRcate Pachetul bioconductor [16]. Analiza a fost efectuată pe valorile M utilizând parametrii impliciți. Testarea setului de gene în aval a fost efectuată pe o listă filtrată de DMR cu o medie |Δβ| ≥ 0,1 și cel puțin 3 CpG subiacente.

Termenii GO au fost testați pentru îmbogățirea genelor asociate DMR folosind goregiune și un HGT standard, așa cum este implementat în funcția goana din limma Pachet de bioconductori. O genă, așa cum este definită în TxDb.Hsapiens.UCSC.hg19.knownGene Pachetul bioconductor, a fost inclus în lista de gene care urmează să fie testate folosind goana dacă se suprapunea unui DMR cu cel puțin 1 pb.

Evaluarea GOregion utilizând date de dezvoltare a celulelor pre-B

Datele lllumina Infinium HumanMethylation450 (GSE45459) generate din 4 etape ale dezvoltării celulelor pre B au fost utilizate pentru identificarea DMR. Datele au fost prelucrate așa cum s-a descris anterior. DMR-urile dintre Etapa 1 și Etapa 2 au fost identificate folosind DMRcate Pachet de bioconductori [16]. Analiza a fost efectuată pe valorile M utilizând parametrii impliciți. DMR-urile nu au fost filtrate înainte de testarea setului de gene.

Termenii GO au fost testați pentru îmbogățirea genelor asociate DMR folosind goregiune și un HGT standard, așa cum a fost descris anterior pentru datele de celule sanguine sortate.


Ghid de inspecție în biotehnologie (11/91)

Notă: Acest document este material de referință pentru anchetatori și alt personal al FDA. Documentul nu obligă FDA și nu conferă drepturi, privilegii, beneficii sau imunități pentru sau asupra oricărei persoane.

MULȚUMIRI

Acest Ghid a fost inițiat de Robert C. Fish, Director, Divizia de Investigații de teren (DFI). Dl. Fish a cerut Barbara-Helene Mith, Ph.D., DIB, CHI-DO, să prezideze un grup de lucru pentru a dezvolta linii directoare de inspecție pentru anchetatori în domeniul biotehnologiei. Grupul de lucru, care a inclus și Thaddeus T. Sze, Ph.D., inginer chimist, DFI, și Kim A. Rice, investigator de supraveghere, SEA-DO, a pregătit o schiță de document cu informații obținute de la personalul FDA Center și Field care este activ implicat în inspecțiile biotehnologice.

Documentul a fost revizuit și extins în cadrul unui atelier de 2 l / 2 zile (29-3 mai, l99l) la care au participat următorii angajați ai Centrului și Terenului: Wendy Aaronson (CBER), Henry Avallone (NWK-DO), Yuan-Yuan Chiu , Doctorat (CDER), Vitolis Vengris, D.V.M., Ph.D. (CVM), John Ingalls (BOS-DO), Rita Jhangiani (PHI-DO), George Kroehling (CDRH), Seth Pauker, Ph.D. (OB), Pearl Tanjuaquio (LOS-DO), Frank Twardochleb (CDRH) și Sylvia Yetts (DAL-DO).

Dorim să ne exprimăm aprecierea față de toți cei care au împărtășit rapoartele de inspecție și FDA-483, au contribuit cu expertiza tehnică, au oferit comentarii și au asistat la pregătirea acestui ghid. Mulțumiri speciale doamnei Kimberly Search (DFI) pentru asistența ei expertă de birou.

CUPRINS

GHID DE INSPECȚIE A BIOTEHNOLOGIEI PENTRU INVESTIGATORI

INTRODUCERE

Biotehnologia, definită ca „aplicarea sistemelor și organismelor biologice la procesele tehnice și industriale”, nu este nouă. Utilizarea drojdiei pentru a fermenta cerealele în alcool este în desfășurare de secole. La fel, fermierii și crescătorii folosesc o formă de „inginerie genetică” pentru a produce recolte și stocuri îmbunătățite prin selectarea caracteristicilor dorite la plante și animale. Doar recent tehnicile de biotehnologie „noile” au permis oamenilor de știință să modifice materialul genetic al unui organism la nivel celular sau molecular. Aceste metode sunt mai precise, dar rezultatele sunt similare cu cele produse prin tehnici genetice clasice care implică organisme întregi. Produsele derivate din biotehnologie (BDP) utilizate în acest ghid se referă la acele produse derivate din noile tehnici biotehnologice.

Dezvoltarea BDP și inspecția fabricării și controlului acestor produse oferă multe provocări. Datorită proceselor diversificate de fabricație și control care se dezvoltă continuu, este necesar un efort considerabil pentru a atinge un nivel de competență tehnică pentru inspectarea acestor operațiuni. Deși nivelul tehnologiei este în creștere, trebuie să se recunoască faptul că aceleași reglementări și cerințe de bază se aplică la fabricarea și controlul substanțelor și dispozitivelor derivate din biotehnie ca și pentru produsele fabricate „în mod convențional”.

Aceleași criterii au fost folosite de mai mulți ani în inspecția producătorilor de antibiotice, enzime și alte substanțe cu greutate moleculară ridicată, inclusiv insulină, heparină și albumină. Acest ghid va aborda unele dintre problemele de bază identificate în timpul inspecțiilor producătorilor de BDP. Sistemele de producție pot include animale, clone celulare (de exemplu hibridom), culturi de celule de mamifere și insecte, drojdie și bacterii sau combinații ale acestor sisteme.

Obiectivul major al unei inspecții este de a determina dacă producătorul funcționează într-o stare de control și în conformitate cu legile și reglementările. Angajamentul firmei pentru calitate este vital, indiferent de tipul de companie sau produs care este fabricat.

Un aspect important al unei inspecții este identificarea produselor defecte, a produselor neconforme și a defecțiunilor sistemului. Modul în care companiile investighează și corectează condițiile inacceptabile și sistemele de fabricație și control deficiente este o parte importantă a unei inspecții și ilustrează de obicei nivelul de calitate din cadrul unei firme.

Ca și în cazul inspecțiilor de pre-aprobare ale medicamentelor și dispozitivelor de uz uman și veterinar, se recomandă ca inspecțiile firmelor de biotehnologie să fie efectuate de echipe, investigatorul principal fiind responsabil pentru desfășurarea generală a inspecției. Analiștii (chimiștii și/sau microbiologii), specialiștii în calculatoare și inginerii pot participa la toate sau părți ale inspecției. Înainte de inspecție, „echipa” ar trebui să discute despre atribuțiile membrilor echipei.

Inspecția biotehnologică este, de asemenea, o inspecție specifică produsului. Ca și în cazul oricărei inspecții, acoperirea este în general un audit și nu este cuprinzător. Astfel, datele de validare pentru toate sistemele, procesele, controalele și procedurile de testare nu pot fi revizuite. Cu toate acestea, ar trebui să se acorde o acoperire detaliată specifică câtorva sisteme sau controale. O diagramă de flux din documentul de aplicare sau de la firmă ar trebui să fie obținută înainte sau la începutul inspecției, iar etapele specifice de fabricație ar trebui revizuite cu personalul responsabil al producătorului.

CULTURA CELULARĂ ȘI FERMENTAREA

    Master Cell Bank și Working Cell Bank

Materia primă pentru fabricarea BDP include cultura de celule bacteriene, de drojdie, de insecte sau de mamifere care exprimă produsul proteic sau anticorpul monoclonal de interes. Sistemul de loturi de semințe celulare este utilizat de producători pentru a asigura identitatea și puritatea materiei prime de pornire. Un lot de semințe de celule constă din alicote ale unei singure culturi. Banca de celule master (MCB) este derivată dintr-o singură colonie (bacterii, drojdie) sau o singură celulă eucariotă, stocată criogenic pentru a asigura stabilitatea genetică și este compusă din suficiente fiole de cultură pentru a furniza materialul sursă pentru banca de celule de lucru (WCB) . WCB este definit ca o cantitate de celule derivate de la una sau mai multe fiole de MCB, stocate criogenic și utilizate pentru a iniția lotul de producție.

Deoarece stabilitatea genetică a băncii de celule în timpul stocării și propagării este o preocupare majoră, este important să cunoaștem originea și istoricul (numărul de pasaje) atât al MCB, cât și al WCB. O fiolă MCB este păstrată congelată sau liofilizată și utilizată o singură dată. Ocazional, un nou MCB poate fi generat dintr-un WCB. Noul MCB ar trebui testat și caracterizat corespunzător. Pentru produsele biologice, o cerere de licență de produs sau o modificare trebuie depusă și aprobată înainte ca un nou MCB să poată fi generat dintr-un WCB.

Informațiile despre construcția vectorului de expresie, fragmentul care conține materialul genetic care codifică produsul dorit și genotipul și fenotipul relevante ale celulei (celule) gazdă sunt transmise ca parte a unei cereri de produs. Preocupările majore ale sistemelor biologice sunt stabilitatea genetică a băncilor de celule în timpul producției și depozitării, microorganismele contaminante și prezența virusurilor endogene în unele linii celulare de mamifere. Ca parte a documentului de aplicare, producătorii vor prezenta o descriere a tuturor testelor efectuate pentru a caracteriza și califica o bancă de celule.

Trebuie subliniat faptul că testele necesare pentru caracterizarea unei bănci de celule vor depinde de utilizarea intenționată a produsului final, de sistemul gazdă / expresie și de metoda de producție, inclusiv de tehnicile utilizate pentru purificarea produsului. În plus, tipurile de teste se pot schimba pe măsură ce tehnologia avansează.

MCB este riguros testat. Următoarele teste sunt efectuate în general, dar nu se limitează la:

  1. Caracterizarea genotipică prin amprentarea ADN-ului
  2. Caracterizarea fenotipică după necesitățile de nutrienți, analiza izoenzimelor, creșterea și caracteristicile morfologice
  3. Producția reproductibilă a produsului dorit
  4. Caracterizarea moleculară a vectorului/fragmentului clonat prin cartografierea enzimelor de restricție, analiza secvenței
  5. Analize pentru detectarea contaminării virale
  6. Test de transcriptază inversă pentru detectarea retrovirusurilor
  7. Test de sterilitate și test de micoplasmă pentru a detecta alți contaminanți microbieni

Nu este necesar să testați WCB la fel de extins ca MCB, cu toate acestea, este necesară caracterizarea limitată a unui WCB. Următoarele teste sunt efectuate în general pe WCB, dar această listă nu este inclusă:

  1. Caracterizarea fenotipică
  2. Cartarea enzimelor de restricție
  3. Testarea sterilității și a micoplasmei
  4. Testarea producției reproductibile a produsului dorit

MCB și WCB trebuie depozitate în condiții care asigură stabilitatea genetică. În general, celulele stocate în azot lichid sau faza sa de vapori sunt stabile mai mult decât celulele stocate la -70 C. În plus, se recomandă ca MCB și WCB să fie depozitate în mai multe locații în cazul în care un congelator nu funcționează.

  1. Verificați dacă procedurile scrise reflectă cu exactitate ceea ce este prezentat în documentul de aplicare. b. Stabiliți că înregistrările loturilor urmează proceduri scrise. c. Determinați identitatea și trasabilitatea MCB / WCB. d. Verificați condițiile de depozitare în fiecare locație. e. Verificați accesibilitatea la MCB și WCB. Determinați dacă există măsuri de securitate și jurnale de responsabilitate. f. Documentați toate eșantioanele MCB / WCB care nu au îndeplinit toate specificațiile, mai ales dacă au fost eliberate pentru utilizare.

Materiile prime utilizate pentru a pregăti mediile trebuie selectate cu atenție pentru a asigura rata de creștere adecvată și nutrienții esențiali pentru organismele care produc produsul dorit. Materiile prime nu trebuie să conțină componente nedorite și toxice care pot fi transportate prin cultura celulară, fermentație și procesul de purificare până la produsul finit. Apa este o componentă importantă a mediului, iar calitatea apei va depinde de sistemul recombinant utilizat, de faza de fabricație și de utilizarea prevăzută a produsului. Materiile prime considerate similare atunci când sunt furnizate de un alt furnizor trebuie să îndeplinească criteriile de acceptare înainte de utilizare. În plus, se recomandă o etapă pilot la scară mică, urmată de o producție la scară completă, atunci când sunt utilizate materii prime de la un furnizor diferit, pentru a se asigura că parametrii de creștere, randamentul și purificarea produsului final rămân aceiași.

Majoritatea culturilor de celule de mamifere necesită ser pentru creștere. Frecvent, serul este o sursă de contaminare cu organisme adventive, în special micoplasme, iar firmele trebuie să ia măsuri de precauție pentru a asigura sterilitatea serului. Unele seruri de bovine brazilian (BBS) au fost contaminate cu boala copitei. De asemenea, asigurați-vă că serul este într-adevăr ser bovin și nu este derivat din surse umane.

Există o îngrijorare suplimentară că serul bovin poate fi contaminat cu agent de encefalopatie spongiformă bovină (ESB). ESB este o boală lentă care a fost detectată la efectivele din Regatul Unit. Deoarece nu există nicio analiză sensibilă in vitro pentru a detecta prezența acestui agent, este esențial ca producătorii să cunoască sursa serului și să solicite certificarea că serul nu provine din zone în care ESB este endemică. Alte surse potențiale de ESB pot fi proteazele și alte enzime derivate din surse bovine. Producătorii de produse biologice au fost solicitați să determine originea acestor materiale utilizate în fabricație.

Mediile utilizate trebuie sterilizate. Se utilizează de obicei un proces de sterilizare în loc (SIP) sau un sistem de sterilizare continuă (CSS). Orice nutrienți sau substanțe chimice adăugate dincolo de acest punct trebuie să fie sterile. Conductele de aer trebuie să includă filtre sterile.

  1. Determinați sursa serului.
  2. Confirmați că ciclul de sterilizare a fost validat corespunzător pentru a vă asigura că mediul va fi steril.
  3. Verificați dacă toate materiile prime au fost testate prin controlul calității. Determinați originea tuturor materialelor bovine.
  4. Documentați cazurile în care media nu a îndeplinit toate specificațiile.
  5. Verificați dacă materiile prime expirate nu au fost folosite la fabricație.
  6. Verificați dacă mediile și alți aditivi au fost depozitați corect.

Operațiunile de inoculare, transfer și recoltare a bioreactorului trebuie făcute folosind tehnici aseptice validate. Adăugările sau retragerile din bioreactoarele industriale se fac în general prin linii sterilizate cu abur și ansambluri de blocare cu abur. Aburul poate fi lăsat pornit în situații în care încălzirea liniei sau a peretelui vasului bioreactor nu ar fi dăunătoare culturii.

Este important ca un sistem bioreactor să fie monitorizat îndeaproape și controlat strâns pentru a obține expresia corectă și eficientă a produsului dorit. Parametrii procesului de fermentație trebuie specificați și monitorizați. Acestea pot include: rata de creștere, pH-ul, nivelul subprodusului deșeurilor, vâscozitatea, adăugarea de substanțe chimice, densitatea, amestecarea, aerarea, spumarea etc. Alți factori care pot afecta produsul finit includ forțele de forfecare, căldura generată de proces și eficacitatea sigiliilor. si garnituri.

Mulți parametri de creștere pot influența producția de proteine. Unii dintre acești factori pot afecta deamidarea, formarea izopeptidelor sau prelucrarea proteolitică a celulei gazdă. Deși mediile cu deficit de nutrienți sunt folosite ca mecanism de selecție în anumite cazuri, mediile deficitare în anumiți aminoacizi pot provoca substituții. De exemplu, când E. coli este înfometată de metionină și / sau leucină în timp ce crește, organismul va sintetiza norleucina și o va încorpora într-o poziție ocupată în mod normal de metionină, obținând un analog al proteinei de tip sălbatic. Prezența acestor produse strâns legate va fi dificil de separat cromatografic, aceasta poate avea implicații atât pentru aplicarea specificațiilor de eliberare, cât și pentru eficacitatea procesului de purificare a produsului.

Ar trebui validate programele de calculator utilizate pentru a controla cursul fermentației, înregistrarea datelor și reducerea și analiza datelor.

Sistemele de bioreactoare concepute pentru microorganisme recombinante necesită nu numai menținerea unei culturi pure, ci și menținerea culturii în sisteme. Izolarea poate fi realizată prin alegerea corectă a unui sistem gazdă-vector care este mai puțin capabil să supraviețuiască în afara unui mediu de laborator și prin mijloace fizice, atunci când acest lucru este considerat necesar.

Revizuirea Anexei K a Ghidurilor NIH (1991) reflectă o formalizare a practicilor adecvate de izolare și a facilităților pentru desfășurarea experimentelor la scară largă care implică microorganisme industriale recombinate din ADN. Anexa K înlocuiește porțiuni din apendicele G atunci când cantități de peste 10 litri de cultură sunt implicate în cercetare sau producție. Pentru cercetarea sau producția pe scară largă, sunt stabilite patru niveluri fizice de izolare: GLSP, BL1-LS, BL2-LS și BL3-LS.

Nivelul de izolare fizică (Good Large-ScalePractice) este recomandat pentru cercetarea pe scară largă a producției care implică tulpini recombinante viabile, nepatogene și netoxigenice derivate din organisme gazdă care au un istoric extins sau au o utilizare sigură pe scară largă. Nivelul GLSP de izolare fizică este recomandat pentru organisme precum cele care au încorporate limitări de mediu care permit o creștere optimă la scară largă, dar o supraviețuire limitată fără consecințe adverse asupra mediului.

(Nivelul 1 de biosecuritate 1 - Scală mare) este recomandat un nivel de izolare fizică pentru cercetarea la scară largă sau producerea de organisme viabile care conțin molecule de ADN recombinant care necesită izolare BL1 la scară de laborator.

Nivelul de izolare fizică este necesar pentru cercetarea pe scară largă sau producerea de organisme viabile care conțin molecule de ADN recombinant care necesită izolarea BL2 la scară de laborator.

Nivelul de izolare fizică este necesar pentru cercetarea la scară largă sau producția de organisme viabile care conțin molecule de ADN recombinant care necesită izolare BL3 la scară de laborator.

Nu se prevede în acest moment o cercetare la scară largă sau producția de organisme viabile care conțin molecule de ADN recombinant care necesită izolare BL4 la scară de laborator.

În timpul creșterii celulare nu ar trebui să existe organisme accidentale în sistem. Organismele contaminante din bioreactor pot afecta negativ atât randamentul produsului, cât și capacitatea procesului din aval de a separa și purifica corect proteina dorită. Prezența sau efectele organismelor contaminante în bioreactor pot fi detectate în mai multe moduri - rata de creștere, puritatea culturii, testarea bacteriofagului și profilul acidului gras.

  1. Verificați dacă există proceduri scrise pentru a asigura absența agenților accidentali și criteriile stabilite pentru a respinge cursurile contaminate.
  2. Examinați înregistrările de creștere a celulelor și verificați dacă parametrii de producție sunt consecvenți cu modelul stabilit. c. Revizuiți procedurile scrise pentru a determina ce investigații și acțiuni corective vor fi efectuate în cazul în care parametrii de creștere depășesc limitele stabilite.
  3. Revizuirea procedurilor scrise pentru a determina ce investigații și acțiuni corective vor fi efectuate în cazul în care parametrii de creștere depășesc limitele stabilite.
  4. Asigurați tehnici aseptice adecvate în timpul infiltrației celulare5. Abordarea inspecției:
  5. Stabiliți că sunt utilizate controalele adecvate în timpul procesului înainte de procesarea ulterioară.

ASCITĂ PRODUCȚIA

Anticorpii monoclonali pot fi produși în cultura celulară sau în abdomenul unui șoarece. Există puncte critice unice în producția de ascită care ar trebui examinate.

    Mouse Colony
      Caracterizarea și controlul coloniei mouse-ului

    Caracterizarea și controlul coloniei de șoareci utilizate pentru a produce ascită sunt critice. Trebuie înregistrate tipul de șoarece, sursa, furnizorul și certificarea conform căreia colonia este liberă de boli virale. Animalele utilizate în producție trebuie puse în carantină și inspectate zilnic timp de o săptămână pentru a se asigura că șoarecii rămân în stare bună de sănătate și îndeplinesc toate criteriile de acceptare. Șoarecii trebuie observați zilnic în timpul producției. Ar trebui să existe SOP-uri stricte pentru a elimina orice mouse care nu rămâne în stare de sănătate evidentă în timpul carantinei și al producției.

    Este necesară o atenție strictă la adăposturile animalelor pentru a se asigura că șoarecii rămân liberi de boli, în special viruși care infectează în mod obișnuit coloniile. Pentru a preveni contaminarea coloniilor adăpostite în camere diferite, este o idee bună ca oamenii să poarte mănuși de unică folosință, haine de laborator, învelitoare pentru cap și botine, astfel încât aceste articole să poată fi schimbate înainte de a intra într-o altă cameră. Locuințele și cuștile pentru animale trebuie păstrate în condiții sanitare.

    Șoarecii individuali trebuie identificați astfel încât să se poată păstra cu precizie o înregistrare a numărului de ori când a fost atins un mouse și cantitatea de lichid obținută din fiecare robinet.

    Injectarea șoarecilor și îndepărtarea lichidului de ascită trebuie făcute într-un mediu curat, cum ar fi sub o hotă unidirecțională sau la o stație care va proteja șoarecii de agenții infecțioși. Ar trebui să existe proceduri scrise care să descrie procesul de atingere. Se recomandă un ac diferit pentru fiecare șoarece pentru a preveni posibilitatea transmiterii infecțiilor de la alți șoareci. De asemenea, ar trebui să existe proceduri scrise pentru manipularea acelor, cu respectarea strictă a izolării periculoase biologice pentru a preveni contaminarea încrucișată.

    În plus, ar trebui să existe proceduri scrise care să descrie temperaturile și condițiile de depozitare înainte de procesare. Aceasta va include stabilirea unei limite de timp pentru colectare și prelucrare. Regruparea ascitei este acceptabilă, dar ar trebui să existe proceduri scrise care să descrie modul în care se face un bazin (câți și ce șoareci alcătuiesc un bazin) și înregistrările trebuie să reflecte cu exactitate ceea ce alcătuiește piscina. Astfel, dacă se descoperă că un animal este infectat, înregistrările vor reflecta ce bazin conține lichidul de ascită al animalului infectat.

    Pristane este uneori folosit pentru a amorsa șoarecii și pentru a îmbunătăți producția de ascite. Pentru produsele parenterale, firma trebuie să demonstreze că procesul de purificare va elimina pristanul. Acest lucru nu ar trebui să fie o problemă pentru produsele utilizate în dispozitivele de diagnostic in vitro.

    1. Revizuirea SOP-urilor pentru a asigura controale adecvate pentru carantinarea și acceptarea șoarecilor, adăpostirea și îngrijirea șoarecilor, identificarea șoarecilor, menținerea unui mediu curat pentru a preveni infecția virală a coloniei, eliminarea șoarecilor nesănătoși și prelucrarea lichidului de ascită.
    2. Verificați înregistrările pentru a vă asigura că animalele sunt în stare bună de sănătate și sunt observate zilnic în timpul perioadei de carantină și a producției.
    3. Verificați prezența unui personal calificat pentru îngrijirea animalelor.

    EXTRACȚIE, ISOLARE ȘI PURIFICARE

    Odată ce procesul de fermentare este finalizat, produsul dorit este separat și, dacă este necesar, repliat pentru a restabili integritatea configurației și purificat. Pentru recuperarea proteinelor intracelulare, celulele trebuie perturbate după fermentare. Acest lucru se realizează prin metode chimice, enzimatice sau fizice. După întrerupere, resturile celulare pot fi îndepărtate prin centrifugare sau filtrare. Pentru recuperarea proteinei extracelulare, separarea primară a produsului de organismele producătoare se realizează prin centrifugare sau filtrare prin membrană. Metodele inițiale de separare, cum ar fi precipitarea sulfatului de amoniu și separarea apoasă în două faze, pot fi utilizate după centrifugare pentru a concentra produsele. Etapele ulterioare de purificare implică în primul rând metode cromatografice pentru a elimina impuritățile și a aduce produsul mai aproape de specificațiile finale.

    1. Extracție și izolare
      1. Filtrare -Ultrafiltrarea este utilizată în mod obișnuit pentru a îndepărta produsul dorit din resturile celulare. Porozitatea filtrului cu membrană este calibrată la o anumită greutate moleculară, permițând moleculelor sub acea greutate să treacă în timp ce rețin moleculele peste această greutate.
      2. Centrifugare -Centrifugarea poate fi deschisă sau închisă. Adecvarea mediului trebuie evaluată pentru centrifugare deschisă.
      1. Cromatografia de afinitate
      2. Cromatografie cu schimb de ioni (IEC)
      3. Filtrarea cu gel
      4. Cromatografia de interacțiune hidrofobă (HIC)
      5. HPLC cu fază inversă

      Toate etapele de separare și purificare trebuie descrise în detaliu și prezentate cu diagrame de flux. Ar trebui furnizate descrieri și specificații adecvate pentru toate echipamentele, coloanele, reactivii, tampoanele și randamentele preconizate. Atunci când este cazul, procedurile scrise ar trebui comparate cu documentele de cerere prezentate agenției. Condițiile de depozitare în timpul procesului și testele de control al calității ar trebui revizuite.

      FDA a definit validarea procesului în „Ghidul privind principiile generale de validare a procesului” din mai 1987, după cum urmează:

      Validare - stabilirea dovezilor documentate care oferă un grad ridicat de asigurare că un proces specific va produce în mod consecvent un produs care îndeplinește specificațiile și atributele sale de calitate prestabilite.

      Ne așteptăm să vedem documentație care justifică procesul și demonstrează că procesul funcționează în mod constant. Pentru produsele biologice, toate datele de validare sunt transmise și revizuite, iar specificațiile sunt stabilite și aprobate ca parte a cererii de licență a produsului (PLA).

      Producătorii ar trebui să aibă rapoarte de validare pentru diferitele etape cheie ale procesului. De exemplu, dacă o coloană cu schimb de ioni este utilizată pentru a elimina endotoxinele, ar trebui să existe date care să documenteze că acest proces este eficient în mod constant. Prin determinarea nivelurilor de endotoxină înainte și după prelucrare, un producător ar trebui să poată demonstra validitatea acestui proces. Este important să monitorizați procesul înainte, în timpul și după, pentru a determina eficiența fiecărei etape de purificare cheie. „Stropirea” preparatului cu o cantitate cunoscută de contaminant pentru a demonstra îndepărtarea acestuia poate fi o metodă utilă pentru validarea procedurii.

      De obicei, producătorii dezvoltă procese de purificare la scară mică și determină eficacitatea etapei de procesare. Când se realizează extinderea, trebuie luate în considerare câteva diferențe în comparație cu operațiunea la scară de laborator. Timpii de procesare mai lungi pot afecta negativ calitatea produsului, deoarece produsul este expus la condiții de tampon și temperatură pentru perioade mai lungi. Stabilitatea produsului, în condiții de purificare, trebuie definită cu atenție. Producătorii ar trebui să definească limitările și eficacitatea acestei etape. Validarea procesului pe lotul de dimensiuni de producție va compara apoi efectul extinderii. Producătorii pot folosi uneori date de dezvoltare pe scară mică pentru validare. Cu toate acestea, este important ca validarea să fie efectuată pe loturile de mărime de producție.

      Validarea procesului și / sau rapoartele pentru validarea unora dintre procesele de purificare ar trebui revizuite. În plus, controalele și testele utilizate pentru a asigura coerența procesului ar trebui, de asemenea, să fie revizuite.

      Adesea coloanele sunt regenerate pentru a permite utilizarea repetată. Trebuie efectuate proceduri de validare adecvate, iar procesul trebuie monitorizat periodic pentru contaminarea chimică și microbiană.

      Producătorii resping ocazional produsul în urma procesului de purificare. Ca și în cazul altor produse reglementate, este de așteptat ca rapoartele investigațiilor să fie complete și să se refere la alte loturi. De exemplu, în timpul unei inspecții, sa observat că aproximativ șase loturi de BDP au fost respinse din cauza potenței scăzute și a nivelurilor ridicate de impurități. Problema a fost atribuită unei coloane și toate loturile procesate pe coloană au fost respinse. Trebuie subliniat faptul că orice specificație de defectare a lotului ar trebui investigată.

      Prin urmare, este important să se identifice produsul defect, astfel încât sistemele specifice de fabricație și control să aibă o acoperire mai detaliată a inspecției.

      Calitatea apei ar trebui să depindă de utilizarea prevăzută a produsului finit. De exemplu, CBER necesită calitatea apei pentru injecție (WFI) pentru apa de proces. Pe de altă parte, pentru diagnosticarea in vitro poate fi suficientă apă purificată. Pentru medicamente, calitatea apei necesare depinde de proces. De asemenea, deoarece procesarea are loc de obicei la rece sau la temperatura camerei, se pierde auto-igienizarea unui sistem WFI fierbinte la 75-80 C.

      Din motive economice, multe dintre companiile de biotehnologie produc WFI mai degrabă prin osmoză inversă decât prin distilare. S-a constatat că majoritatea acestor sisteme sunt contaminate. De obicei, acestea folosesc țevi de plastic (PVC) și rezervoare de stocare nesigilate, care sunt greu de igienizat. Orice fire sau picături dintr-un sistem rece oferă o zonă în care microorganismele se pot lăsa și înmulți. Unele dintre sisteme utilizează un filtru terminal de sterilizare. Cu toate acestea, preocuparea principală este endotoxinele, iar filtrul terminal poate servi doar pentru a masca adevărata calitate a WFI utilizat. Ar trebui de asemenea recunoscute limitările de a se baza pe o probă de 0,1 ml de WFI pentru endotoxine dintr-un sistem. Sistemul ar trebui să fie proiectat pentru a furniza apă de înaltă puritate, eșantionul servind doar pentru a se asigura că funcționează corespunzător. Ca și în cazul altor sisteme WFI, dacă este necesară apă rece WFI, pot fi utilizate schimbătoare de căldură la punctul de utilizare.

      Tampoanele pot fi fabricate ca soluții sterile, nepirogene și depozitate în recipiente sterile. Unele dintre instalațiile mai mici au achiziționat soluții tampon comerciale sterile, nepirogene.

      Producția și / sau depozitarea apei nesterile care pot fi de calitate reactivă sau utilizate ca tampon trebuie evaluate atât din punct de vedere al stabilității, cât și din punct de vedere microbiologic.

      Sistemele WFI pentru BDP sunt aceleași cu sistemele WFI pentru alte produse reglementate. Ca și în cazul altor produse sensibile la căldură, WFI rece este utilizat pentru formulare. Sistemele reci sunt predispuse la contaminare. WFI rece ar trebui monitorizat atât pentru endotoxine, cât și pentru microorganisme. Datele de validare și rapoartele de monitorizare ar trebui revizuite.

      Calitatea microbiologică a mediului în timpul diferitelor etape de procesare este o preocupare. Pe măsură ce procesul continuă în aval, ar trebui să se acorde o atenție sporită controalelor și monitorizării mediului. Mediul și zonele utilizate pentru izolarea BDP ar trebui, de asemenea, să fie controlate pentru a reduce la minimum contaminanții microbiologici și alți contaminanți străini. Izolarea tipică a BDP ar trebui să aibă același control cu ​​mediul utilizat pentru formularea soluției înainte de sterilizare și umplere.

      PROCEDURA DE CURĂȚARE

      Validarea procedurilor de curățare pentru prelucrarea echipamentelor, inclusiv a coloanelor, trebuie efectuată. Acest lucru este deosebit de critic pentru o instalație cu mai multe produse. Producătorul ar fi trebuit să determine gradul de eficacitate al procedurii de curățare pentru fiecare BDP sau intermediar utilizat în acea echipament special.

      Datele de validare ar trebui să verifice dacă procesul de curățare va reduce reziduurile specifice la un nivel acceptabil. Cu toate acestea, este posibil să nu fie posibilă îndepărtarea absolută a oricărei urme de material, chiar și cu un număr rezonabil de cicluri de curățare. Nivelul permis de reziduuri, exprimat în general în părți pe milion (ppm), ar trebui să fie justificat de producător. Curățarea trebuie să îndepărteze endotoxinele, bacteriile, elementele toxice și proteinele contaminante, în timp ce nu afectează negativ performanța coloanei. Acoperirea de inspecție specifică pentru curățare ar trebui să includă:

        Procedură detaliată de curățare

      Ar trebui să existe o procedură scrisă de curățare a echipamentului care să ofere detalii despre ceea ce ar trebui făcut și materialele care trebuie utilizate. Unii producători listează solventul specific pentru fiecare BDP și intermediar.

      Pentru navele staționare, se pot întâlni adesea aparate curate în loc (CIP). Pentru evaluarea acestor sisteme vor fi necesare diagrame, împreună cu identificarea supapelor specifice.

      După curățare, ar trebui să existe unele teste de rutină pentru a se asigura că suprafața a fost curățată la nivelul validat. O metodă comună este analiza apei de clătire finală sau a solventului pentru prezența agenților de curățare utilizați ultima dată în acel echipament. Ar trebui să existe întotdeauna o determinare directă a substanței reziduale.

      O parte a răspunsului la întrebarea „cât de curat este curat?”, este „cât de bun este sistemul tău analitic?” Sensibilitatea aparatelor analitice moderne a scăzut unele praguri de detecție sub părți pe milion (ppm), până la părți pe miliard (ppb).

      Limitele de reziduuri stabilite pentru fiecare aparat trebuie să fie practice, realizabile și verificabile. Când revedeți aceste limite, stabiliți rațiunea stabilirii la acel nivel. Producătorul ar trebui să poată documenta, prin intermediul datelor, că nivelul rezidual permis are o bază solidă din punct de vedere științific.

      Un alt factor de luat în considerare este posibila distribuție neuniformă a reziduului pe un echipament. Concentrația medie reală a reziduurilor poate fi mai mare decât nivelul detectat.

      PRELUCRARE ȘI UMPLERE

      Majoritatea BDP nu poate fi sterilizat terminal și trebuie fabricat prin prelucrare aseptică. Prezența contaminanților legați de proces într-un produs sau dispozitiv este în principal o problemă de siguranță. Sursele de contaminanți sunt în primul rând substratul celular (ADN, proteinele celulei gazdă și alți constituenți celulari, viruși), mediile (proteine, seruri și aditivi) și procesul de purificare (substanțe chimice legate de proces și impurități legate de produs).

      Din considerente de stabilitate, majoritatea BDP sunt fie refrigerate, fie liofilizate. Temperaturile scăzute și conținutul scăzut de umiditate sunt, de asemenea, de descurajare a proliferării microbiologice. Pentru validarea procesării aseptice a produsului biofarmaceutic neconservat în doză unică (care este umplut aseptic) depozitat la temperatura camerei ca soluție, trebuie recunoscute limitările ratei de contaminare a umplerii cu mediu de 0,1%.

      Datele de umplere a materialelor și validarea procesului de fabricație aseptic ar trebui revizuite în timpul unei inspecții. Este posibil ca unele BDP să nu fie foarte stabile și să necesite o amestecare și o prelucrare ușoare. În timp ce filtrările duble sunt relativ comune pentru parenterale umplute aseptic, filtrarea unică la presiuni scăzute este de obicei efectuată pentru BDP. Din acest motiv, instrucțiunile de fabricație trebuie să fie specifice, cu presiuni maxime de filtrare date.

      Inspecția ar trebui să includă o revizuire a instrucțiunilor de fabricație din înregistrările loturilor pentru a se asigura că acestea sunt complete și specifice.

      Mediul și accesibilitatea pentru lotul BDP nesteril trebuie controlate. Deoarece multe dintre aceste produse nu au conservanți, activitate bacteriostatică inerentă sau fungistatică, sarcina biologică înainte de sterilizare ar trebui să fie scăzută, iar sarcina biologică trebuie determinată înainte de sterilizarea acestor soluții în vrac și înainte de umplere. În mod evident, dotarea sau combinarea acestor soluții în vrac ar trebui controlată pentru a preveni orice creștere potențială a nivelurilor microbiologice care poate apărea până la momentul în care soluțiile vrac sunt filtrate (sterilizate). O preocupare cu orice nivel microbiologic este posibila creștere a endotoxinelor care se pot dezvolta. Buna practică pentru combinarea acestor produse ar include, de asemenea, dozarea într-un mediu controlat și în rezervoare sigilate, în special dacă soluția urmează să fie depozitată înainte de sterilizare. Buna practică ar include, de asemenea, limitări ale duratei de fabricație între formulare și sterilizare.

      Testarea în proces este o parte esențială a controlului calității și asigură faptul că performanța reală, în timp real, a unei operațiuni este acceptabilă. Exemple de controale în proces sunt: ​​parametrii fluxului, profilurile de cromatografie, speciile de proteine ​​și concentrațiile de proteine, bioactivitatea, sarcina și nivelurile de endotoxină. Acest set de controale în proces și selectarea criteriilor de acceptare necesită coordonarea cu rezultatele din programul de validare.

      Umplerea BDP în fiole sau flacoane prezintă multe dintre aceleași probleme ca și la procesarea produselor convenționale. În companiile consacrate, aceste probleme sunt relativ de rutină. Cu toate acestea, pentru noua facilitate BDP, încercarea de a dezvolta și dovedi eficacitatea clinică și siguranța, împreună cu validarea operațiilor, echipamentelor și sistemelor sterile, poate fi un proces îndelungat, mai ales dacă cerințele nu sunt înțelese în mod clar.

      Dimensiunea lotului unui BDP, cel puțin atunci când este produs inițial, va fi probabil mică. Din cauza dimensiunii mici a lotului, liniile de umplere pot să nu fie la fel de automatizate ca pentru alte produse umplute de obicei în cantități mai mari. Astfel, există o implicare mai mare a persoanelor care umplu aceste produse, în special la unele dintre companiile mai mici și mai noi.

      Problemele care au fost identificate în timpul umplerii includ programe inadecvate de monitorizare a mediului cu deficiențe de îmbrăcăminte, oprirea manuală a flacoanelor, în special cele care urmează a fi liofilizate și eșecul validării unor procese de sterilizare de bază. Datorită implicării active a oamenilor în umplere și manipulări aseptice, numărul persoanelor implicate în aceste operațiuni ar trebui redus la minimum, iar un program de mediu ar trebui să includă o evaluare a probelor microbiologice prelevate de la persoanele care lucrează în zone de procesare aseptice. Acest program împreună cu datele ar trebui revizuite în timpul inspecției.

      O altă preocupare cu privire la stabilitatea produsului este utilizarea gazului inert pentru a deplasa oxigenul atât în ​​timpul procesării, cât și al umplerii soluției. Ca și în cazul altor produse care pot fi sensibile la oxidare, trebuie stabilite limite pentru nivelurile de oxigen dizolvat pentru soluție. De asemenea, validarea operației de umplere ar trebui să includă parametri precum viteza liniei și amplasarea seringilor de umplere în ceea ce privește închiderea, pentru a asigura expunerea minimă la aer (oxigen) pentru produsele sensibile la oxigen. În absența deplasării gazelor inerte, producătorul ar trebui să poată demonstra că produsul nu este afectat de oxigen. Aceste date pot fi revizuite în timpul unei inspecții (Aceste date sunt evaluate ca parte a revizuirii aplicației de licențiere a produsului (PLA)).

      De obicei, flacoanele care trebuie liofilizate sunt parțial oprite de mașină. Cu toate acestea, au fost observate câteva linii de umplere care utilizează un operator pentru a plasa fiecare dop pe partea superioară a flaconului cu mâna. Preocuparea este calea imediată de contaminare oferită de operator. Ar trebui efectuate observația operatorilor și revizuirea activă a operațiunilor de umplere.

      O altă preocupare majoră cu operația de umplere a unui produs liofilizat este asigurarea volumelor de umplere. Evident, o umplere redusă ar reprezenta o subpotență în flacon. Spre deosebire de o umplutură sub formă de pulbere sau lichid, o umplere scăzută nu ar fi ușor evidentă după liofilizare, în special pentru un produs în care ingredientul activ poate fi doar un miligram. Datorită semnificației clinice, subpotența într-un flacon poate fi o situație foarte gravă clinic.

      Din nou, inspecția ar trebui să includă observarea și revizuirea operațiunilor de umplere, nu numai în ceea ce privește practicile aseptice, ci și pentru uniformitatea umplerii.

      Multe produse sunt liofilizate din motive de stabilitate. Din păcate, aspectele GMP ale proiectării liofilizatorilor au rămas în urma tehnologiei de sterilizare și control utilizate pentru alte echipamente de procesare. Nu este surprinzător faptul că au fost identificate multe probleme cu procesul de liofilizare.

      Aceste probleme nu se limitează la BDP, ci se referă în general la liofilizarea tuturor produselor, inclusiv BDP. O discuție detaliată despre liofilizare și controale poate fi găsită în Ghidul Tehnic de Inspecție Nr. 43, publicat în 18/04/86.

      CONTROLUL LABORATORULUI

      În timpul inspecției instalației de laborator a firmei, următoarele zone ar trebui revizuite și orice deficiențe ar trebui documentate:

      Personalul de laborator ar trebui să fie pregătit corespunzător pentru sarcinile pe care le execută.

      Firmele ar trebui să aibă documentație și programe pentru întreținerea, calibrarea și monitorizarea echipamentelor de laborator implicate în măsurarea, testarea și depozitarea materiilor prime, a produselor, a probelor și a reactivilor de referință.

      Toate metodele de laborator trebuie validate cu echipamentele și reactivii specificați în metodele de testare. Schimbările la furnizor și / sau specificațiile echipamentelor / reactivilor majori ar necesita revalidare.

      Firmele ar trebui să aibă date brute pentru a sprijini parametrii de validare în cererile depuse.

      Standardele de referință ar trebui să fie bine caracterizate și documentate, stocate corespunzător, securizate și utilizate în timpul testării.

      Culturile și reactivii de laborator, cum ar fi enzimele, anticorpii, reactivii de testare etc., se pot degrada dacă nu sunt ținute în condiții adecvate de depozitare.

      Procedurile trebuie scrise, aplicabile și urmate. Probele de control al calității ar trebui să fie separate și stocate corespunzător.

      Următoarele teste pot fi aplicabile testării componentelor, în proces, în vrac și / sau a produsului final. Testele necesare vor depinde de proces și de utilizarea intenționată a produsului.

      Contaminarea cu pirogeni - Testarea pirogenității trebuie efectuată prin injectarea iepurilor cu produsul final sau prin testul lizat de amebocite limulus (LAL). Aceleași criterii utilizate pentru acceptarea produsului natural ar trebui utilizate pentru produsul biotehnologic.

      Prezența endotoxinelor în unele produse de diagnostic in vitro poate interfera cu performanța dispozitivului. De asemenea, este esențial ca produsele in vivo să fie testate pentru detectarea pirogenilor. Anumite produse farmaceutice biologice sunt pirogene la om, în ciuda faptului că au trecut testul LAL și testul pirogenului de iepure. Acest fenomen se poate datora materialelor care par a fi pirogene numai la om. Pentru a încerca să prezică dacă subiecții umani vor experimenta un răspuns pirogenic, se utilizează un test de pirogen endogen. Celulele mononucleare din sânge uman sunt cultivate in vitro cu produsul final, iar lichidul de cultură celulară este injectat la iepuri. O febră la iepuri indică faptul că produsul conține o substanță care poate fi pirogenă la om.

      Teste care pot fi întâlnite:

      Contaminare virală - Testele de contaminare virală trebuie să fie adecvate substratului celular și condițiilor de cultură utilizate. Ar trebui demonstrată absența virușilor adventivi detectabili care contaminează produsul final.

      Teste care pot fi întâlnite:

      Contaminarea cu acid nucleic - Îngrijorarea cu privire la impuritățile acidului nucleic apare din posibilitatea evenimentelor de transformare celulară la un destinatar. Îndepărtarea acidului nucleic la fiecare etapă a procesului de purificare poate fi demonstrată în experimente pilot prin examinarea gradului de eliminare a ADN-ului celulei gazdă adăugat. O astfel de analiză ar oferi amploarea teoretică a eliminării acidului nucleic în timpul purificării.

      Analizele directe ale acidului nucleic din mai multe loturi de producție ale produsului final ar trebui efectuate prin analiza de hibridizare a acidului nucleic contaminant imobilizat utilizând sonde adecvate, cum ar fi celula gazdă tradusă prin porecare și ADN-ul vector. Preocupările teoretice privind transformarea ADN-ului derivat din substratul celular vor fi minimizate prin reducerea generală a acidului nucleic contaminant.

      Teste care pot fi întâlnite pentru proteinele legate de produs:

      Teste care pot fi întâlnite pentru proteinele străine:

      Contaminarea microbiană - Ar trebui efectuate teste adecvate pentru contaminarea microbiană care să demonstreze absența bacteriilor detectabile (aerobi și anaerobi), ciuperci, drojdie și micoplasme, atunci când este cazul.

      Teste care pot fi întâlnite:

      Contaminanți chimici - Trebuie luate în considerare alte surse de contaminare, de exemplu, alergeni, uleiuri petroliere, solvenți reziduali, materiale de curățare, materiale leșibile pe coloană etc.

      1. Calitate
        1. Culoare / Aspect / Claritate
        2. Analiza particulelor
        3. Determinarea pH-ului
        4. Conținutul de umiditate
        5. ADN-ul celulei gazdă

        Un singur test de identitate poate să nu fie suficient. Este necesară confirmarea faptului că metodele utilizate sunt validate. Ar trebui verificată disponibilitatea materialului de referință. O comparație a produsului cu preparatul de referință într-un biotest adecvat va oferi dovezi suplimentare referitoare la identitatea și potența produsului.

        Teste care pot fi întâlnite:

        1. Cartografierea peptidelor (redusă / non-redusă)
        2. Electroforeză cu gel
          • PAGINA SDS
          • Focalizare Isoelectrică (IEF)
          • Imunoelectroforeză
        3. Electroforeză bidimensională
        4. Electroforeza capilară
        5. HPLC (retenție cromografică)
          • Imunotest
          • ELISA
          • Western Blot
          • Radioimunotest
        6. Analiza aminoacizilor
        7. Secvențierea aminoacizilor
        8. Spectroscopie de masă
        9. Greutate moleculară (PAGINA SDS)
        10. Analiza compoziției carbohidraților (glicozilare)

        Teste care pot fi întâlnite:

        • Cuantificări de proteine
        • Lowry
        • Metoda Biuret
        • Spectrofotometrie UV
        • HPLC
        • Analiza aminoacizilor
        • *Analiza secventa partiala

        „Puritate” înseamnă libertate relativă de materii străine din produsul finit, indiferent dacă este sau nu dăunător destinatarului sau dăunător produsului. Puritatea include, dar nu se limitează la, lipsa relativă de umiditate reziduală sau alte substanțe volatile și substanțe pirogene. Impuritățile proteice sunt cei mai frecvenți contaminanți. Acestea pot apărea din procesul de fermentare, medii sau organismul gazdă. Retrovirusurile endogene pot fi prezente în hibridomele utilizate pentru producerea de anticorpi monoclonali. Testarea specifică pentru acești constituenți este imperativă în produsele in vivo.Îndepărtarea proteinelor antigenice străine este esențială pentru a asigura siguranța și eficacitatea produsului.

        Teste care pot fi întâlnite:

        1. Teste pentru impuritățile proteinelor:
          1. Electroforeză
            • PAGINA SDS
            • IEF
            • Electroforeză bidimensională
          2. Cartografierea peptidelor
          3. ELISA multiantigen
          4. Excluderea mărimii HPLC HPLC HPLC cu fază inversă
          1. Hibridizarea ADN-ului
          2. HPLC
          3. Testarea pirogenului/endotoxinei
            • S.U.A. Testul pirogenului la iepure
            • Limulus Amebocyte Lizat (LAL) E
            • Test pirogen ndogen
          • S.U.A. Testul pirogenului de iepure
          • Lizat de amebocit limulus (LAL)
          • Analiza pirogenului endogen
          • Efect citopatic în mai multe tipuri de celule
          • Testarea ouălor embrionate de hemabsorbție
          • Reacția în lanț a polimerazei (PCR)
          • Test imunologic de antigen și anticorp viral
          • Producția de anticorpi mouse (MAP)
          • Hibridizarea ADN-ului (Dot Blot)
          • Reacția în lanț a polimerazei (PCR)
          • PAGINA SDS
          • PLC
          • IEF
          • Imunoanalize
          • Radioimunoteste
          • ELISA
          • Western Blot
          • Pagina SDS
          • Electroforeză bidimensională
          • S.U.A. Test de sterilitate
          • Numărul de plăci heterotrofe și totalul drojdiilor și mucegaiurilor
          • Numărul total de plăci
          • Testul Mycoplasma
          • LAL/Pyrogen

          „Potența” este interpretată ca însemnând capacitatea sau capacitatea specifică a produsului, după cum se indică prin teste de laborator adecvate sau prin date clinice controlate în mod adecvat obținute prin administrarea produsului în modul dorit, de a produce un rezultat dat. Testele pentru potență ar trebui să conste fie din teste in vitro, fie in vivo, sau din ambele, care au fost special concepute pentru fiecare produs, astfel încât să indice potența acestuia. Ar trebui stabilit un preparat de referință pentru activitatea biologică și utilizat pentru a determina bioactivitatea produsului final. Notă: Acolo unde este cazul, standardele interne de potență biologică ar trebui să fie încrucișate cu cele internaționale (Organizația Mondială a Sănătății (OMS), Institutul Național de Standarde și Control Biologic (NIBSC)) sau naționale (Institutele Naționale de Sănătate (NIH), National Cancer). Institute (NCI), Food and Drug Administration (FDA)) preparate standard de referință sau standarde USP.

          Teste care pot fi întâlnite:

          1. Metodă validată de determinare a potenței
            • Bioanalize întregi de animale
            • Bioanalize de cultură celulară
            • Teste biochimice/biofizice
            • Imunoanalize pe bază de receptor
          2. Limite de potență
          3. Identificarea agenților care pot afecta negativ potența
          4. Evaluarea activității funcționale și specificitatea antigenului / anticorpului
            • Diverse metode de imunodifuzie (simple/duble)
            • Imunoteste imunoblotante / radio-enzimatice
          5. Validat HPLC pentru a corela anumite vârfuri cu activitatea biologică

          „Stabilitatea” este capacitatea unui produs de a rămâne în specificațiile stabilite pentru a-i asigura identitatea, rezistența, calitatea, puritatea, siguranța și eficacitatea în funcție de timp. Studiile pentru susținerea perioadei de întâlnire propuse ar trebui efectuate pe produsul final. Datele de stabilitate în timp real ar fi esențiale pentru a susține perioada de întâlnire propusă. Testarea poate include stabilitatea potenței, pH-ul, claritatea, culoarea, particulele, stabilitatea fizico-chimică, umiditatea și conservanții. Datele de testare a stabilității accelerate pot fi utilizate ca date de susținere. Testele accelerate sau testele de stres sunt studii concepute pentru a crește raportul de degradare chimică sau fizică a unei substanțe sau a unui produs prin utilizarea unor condiții de depozitare exagerate. Scopul este de a determina parametrii cinetici pentru a prezice perioada de datare a expirării provizorii. Testarea la stres a produsului este frecvent utilizată pentru a identifica problemele potențiale care pot apărea în timpul depozitării și transportului și pentru a furniza o estimare a perioadei de datare a expirării. Acesta ar trebui să includă un studiu al efectelor fluctuațiilor de temperatură, în funcție de condițiile de transport și depozitare. Aceste teste ar trebui să stabilească o perioadă de datare valabilă în condiții realiste de teren cu containerele și închiderile destinate produsului comercializat.

          Unele proteine ​​relativ fragile derivate din biotehnică pot necesita o amestecare și o prelucrare ușoare și doar o singură filtrare la presiune scăzută. Directiile de fabricatie trebuie sa fie specifice cu presiuni maxime de filtrare date pentru a mentine stabilitatea produsului final. Produsele care conțin conservanți pentru a controla contaminarea microbiană ar trebui să aibă un conținut de conservant monitorizat. Acest lucru poate fi realizat prin efectuarea de teste de provocare microbiană (adică testul de eficacitate conservant antimicrobian din S.U.A.) sau prin efectuarea de teste chimice pentru conservant. Domeniile care ar trebui abordate sunt:

          • Monitorizarea eficientă a mediului de testare a stabilității (de exemplu, lumină, temperatură, umiditate, umiditate reziduală)
          • Container / sistem de închidere utilizat pentru depozitarea în vrac (adică extractabile, modificări chimice ale proteinelor, modificări ale formulărilor de dopuri care pot schimba profilul extractibil)
          • Identificați materialele care ar provoca instabilitatea produsului și testați prezența agregării, denaturării, fragmentării, dezaminării, fotolizei și oxidării
          • Teste pentru determinarea agregatelor sau a produselor de degradare.

          Teste care pot fi întâlnite:

          1. PAGINA SDS
          2. IEF
          3. HPLC
          4. Cromatografia cu schimb de ioni
          5. Filtrarea cu gel
          6. Cartografierea peptidelor
          7. Metode spectrofotometrice
          8. Analize de potență
          9. Test de performanta
          10. Electroforeză bidimensională

          Criteriul de bază pentru a determina dacă un producător produce un produs standardizat și de încredere este demonstrarea consistenței de la lot la lot în raport cu anumite specificații de eliberare predeterminate.

          • Uniformitate: identitate, puritate, activitate funcțională
          • Stabilitate: performanță acceptabilă pe durata de valabilitate, precizie, sensibilitate, specificitate

          ACOPERIREA MEDIULUI

          Acoperirea de mediu / bioconținere pentru instalațiile de biotehnologie ar trebui să fie efectuată ca parte a inspecțiilor periodice GMP, în special inspecții prealabile sau pre-autorizare. FDA este responsabilă, în conformitate cu Legea Națională a Politicii de Mediu (NEPA), pentru a determina impactul asupra mediului care poate apărea din cauza fabricării, utilizării și eliminării produselor reglementate de FDA. Nicio altă agenție de reglementare federală sau de stat nu poate fi informată de FDA cu privire la existența unei cereri de produse neaprobate. În consecință, FDA trebuie să se asigure, de asemenea, că sponsorul produsului efectuează investigații în siguranță.

            Evaluări de mediu

          De obicei, un sponsor al produsului descrie măsurile de control al mediului în evaluările de mediu (EA) care fac parte din aplicarea produsului. Când produsul este aprobat, EA este lansat publicului. FDA trebuie să poată verifica acuratețea și caracterul adecvat al informațiilor conținute în EA. Anchetatorul ar trebui să dețină o copie a evaluării de mediu a firmei, care să abordeze fabricarea produsului care face obiectul inspecției GMP. EA ar trebui să fie solicitată de la biroul de origine dacă nu a fost furnizată.

          1. Revizuiți Ghidurile NIH pentru cercetarea ADN-ului recombinant (1987, 1988, 1991). Acordați o atenție deosebită Anexei K (1991), cu privire la stabilirea de linii directoare pentru nivelul de izolare adecvat bunelor practici industriale la scară largă (a se vedea referințele).
          2. Stabiliți că echipamentele și controalele descrise în EA ca parte a sistemelor de biocontenire și procesare a deșeurilor sunt validate pentru a funcționa conform standardelor în care echipamentul este instalat, funcționează și este întreținut corespunzător. Un astfel de echipament poate include, de exemplu, filtre HEPA, rezervoare de colectare a scurgerilor cu tratament termic sau cu hipoclorit și diguri în jurul bioreactoarelor și canalelor asociate. SOP-urile ar trebui utilizate pentru curățarea deversărilor, pentru acțiuni care trebuie întreprinse în caz de expunere accidentală a personalului, pentru deschiderea și închiderea navelor, pentru prelevarea de probe și manipularea eșantionului și pentru alte proceduri care implică încălcarea rețelei sau în cazul în care expunerea la pot apărea celule vii.
          3. Determinați dacă există un loc de muncă și / sau un program de monitorizare a mediului conceput pentru a verifica dacă organismele sunt supuse unor practici adecvate de bioconținere. Examinați SOP-urile pentru eșantionarea, izolarea, numărarea și raportarea rezultatelor. Obțineți copii ale SOP-urilor relevante și date de monitorizare pentru a fi incluse în rapoarte către sediul central.
          4. Solicitați și obțineți copii ale tuturor autorizațiilor federale, de stat și locale care reglementează emisiile și siguranța la locul de muncă pentru instalația inspectată. Determinați dacă oricare dintre permise a expirat și dacă există vreo acțiune în așteptare referitoare la încălcarea permiselor.
          5. Pentru facilitățile din țări străine, ar trebui urmate aceleași proceduri. Trebuie demonstrată conformitatea cu cerințele țării străine.

          APENDICE:

          METODE DE TESTARE

          Cromatografie de afinitate - O metodă de separare a cromatografiei bazată pe o interacțiune chimică specifică speciei țintă. Tipurile de metode de afinitate sunt: ​​biosorbție -recunoașterea locului (de exemplu, anticorp monoclonal, proteină A) interacțiune hidrofobă-contacte între regiuni nepolare în soluții apoase legarea specifică a ligantului colorant al macromoleculelor de triazină și trifenilmetan coloranți chelat metalic - complexe chelate legate de matrice cu molecula țintă prin schimbul de liganzi legați de metal cu greutate meleculară mică și legătura covalentă - disulfură reversibilă în condiții ușoare.

          Analiza compoziției aminoacizilor - Utilizată pentru a determina compoziția aminoacizilor și / sau cantitatea de proteine. Un proces în două etape care implică o hidroliză completă (chimică sau enzimatică) a proteinei în aminoacizii componente, urmată de separare cromatografică și cuantificare prin HPLC. Compoziția completă de aminoacizi a peptidei sau proteinei trebuie să includă valori exacte pentru metionină, cisteină și triptofan. Compoziția de aminoacizi prezentată ar trebui să fie media a cel puțin trei (3) hidrolizați separați din fiecare număr de lot. Valorile integrale pentru acele resturi de aminoacizi găsite în general în cantități mici, cum ar fi triptofan și / sau metionină, ar putea fi obținute și utilizate pentru a susține argumentele de puritate.

          Secvențierea aminoacizilor - O secvențiere parțială (8-15 reziduuri) a aminoacizilor dintr-o proteină sau polipeptidă fie prin secvențiere amino-terminală, fie carboxi-terminală. Această metodă este realizată pentru a obține informații despre structura primară a proteinei, omogenitatea acesteia și prezența sau absența scindărilor polipeptidice. Datele secvenței determinate prin analiza HPLC sunt prezentate sub formă de tabel și trebuie să includă randamentul total pentru fiecare aminoacid la fiecare ciclu de clivare secvențială. Secvența completă se face adesea prin secvențierea fragmentelor de peptide izolate din fracționarea HPLC.

          Electroforeza capilară - Utilizată ca o completare a HPLC, în special pentru cartografierea peptidelor. Această tehnică este mai rapidă și adesea separă peptidele care se coeluează utilizând HPLC. Separarea se realizează prin mobilitatea relativă a peptidelor într-un tampon ca răspuns la un curent electric.

          Analiza carbohidraților - Utilizată pentru a determina consistența compoziției monozaharidelor legate covalent în glicoproteine. Spre deosebire de lanțul polipeptidic al glicoproteinei în care producția este controlată de codul genetic, oligozaharidele sunt sintetizate de enzime posttranslaționale. Microheterogenitatea lanțurilor de carbohidrați este frecventă. Determinarea se poate realiza pe zaharuri subivatizate după hidroliză prin separare HPLC cu detectare amperometrică pulsată sau prin cromatografie gazoasă după derivatizare.

          Dicroism circular - Cu dispersie optică rotativă, una dintre metodele spectrofotometrice optice utilizate pentru a determina structura secundară și pentru a cuantifica formele structurii specifice (a-helix, folie plisată B și bobină aleatorie) în cadrul unei proteine. Spectrele rezultate sunt comparate cu cea a formei proteice naturale sau cu standardul de referință pentru recombinant.

          Analiza hibridizării ADN (Dot Blot) - Detectarea ADN-ului la nivel de nanogramă folosind hibridizarea ADN-ului celular cu sonde ADN specifice. Manifestarea poate fi prin etichetare cu 32P, chemiluminiscență, teste cromogene sau avidin-biotină.

          Degradare Edman - Un tip de secvențiere a proteinelor de la capătul amino-terminal.

          Electroforeza - Metode în care moleculele sau complexele moleculare sunt separate pe baza capacității lor relative de a migra atunci când sunt plasate într-un câmp electric. Un analit este plasat pe un suport electroforetic, apoi separat prin sarcină (focalizare izoelectrică) sau prin greutate moleculară (SDS-PAGE). Vizualizarea este realizată prin colorarea proteinei cu tehnici de colorare neselectivă (Coomassie Blue) sau selectivă (argintiu).

          Metoda de legare a coloranților utilizând albastru Coomassie este o tehnică cuantificabilă atunci când un densitometru cu laser este utilizat pentru a citi gelurile. Metoda petei de argint este mult mai sensibilă și, prin urmare, este utilizată pentru detectarea nivelurilor scăzute de impurități ale proteinelor, dar datorită variabilității colorării de la proteină la proteină, nu poate fi utilizată pentru cuantificare.

          Electroforeză bidimensională pe gel - Un tip de electroforeză în care proteinele sunt separate mai întâi într-o singură direcție de sarcină, urmată de o separare a dimensiunii în direcția perpendiculară.

          Test imunosorbent legat de enzime (ELISA) - Un test multiantigen pentru proteina celulară reziduală (gazdă) necunoscută și confirmarea proteinei dorite. Poate fi folosit pentru a determina potența unui produs. Este extrem de specific și sensibil, practic simplu și ieftin. Este necesară o preparare standard de referință a impurităților proteinei celulei gazdă pentru a servi ca imunogen pentru prepararea anticorpilor policlonali utilizați pentru test.

          Test pirogen endogen - Test in vitro bazat pe eliberarea pirogenului endogen produs de endotoxina din monocitele umane. Acest test pare a fi mai sensibil decât testul USP Rabbit Pyrogen, dar este mult mai puțin sensibil decât testul LAL. Are avantajul că poate detecta toate substanțele care provoacă un răspuns pirogen de la monocitele umane.

          Cromatografie cu permeație sau filtrare a gelului (excluderea dimensiunii) (GPC, GFC sau SEC) - O metodă de separare bazată pe dimensiunea moleculară sau volumul hidrodinamic al componentelor separate. Acest lucru poate fi realizat cu proteinele în stare naturală sau denaturate cu detergenți.

          Cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC) - O tehnică de separare instrumentală utilizată pentru caracterizarea sau determinarea purității unui BDP prin trecerea produsului (sau peptidelor sale componente sau aminoacizilor) sub formă lichidă pe o coloană cromatografică care conține o matrice solidă de susținere. Modul de separare, adică fază inversă, schimb ionic, filtrare pe gel sau interacțiune hidrofobă, este determinat de matricea coloanei și de faza mobilă. Detectarea se face de obicei prin absorbanță UV sau prin mijloace electrochimice.

          Cromatografie de interacțiune hidrofobă (HIC) - HIC se realizează în mediu sărat ridicat prin legarea porțiunilor hidrofobe ale unei proteine ​​de o suprafață ușor hidrofobă care conține entități precum fenil sau hidrocarburi cu lanț scurt. Proteina poate fi eluată într-un gradient de sare în scădere, ultimele proteine ​​hidrofobe eluând din coloană.

          Imunotest - O tehnică de testare calitativă sau cantitativă bazată pe măsura interacțiunii anticorpului cu afinitate ridicată cu antigenul utilizat pentru identificarea și cuantificarea proteinelor.

          Immunoblotting - O tehnică pentru transferul anticorpului/antigenului dintr-un gel într-un filtru de nitroceluloză pe care pot fi complexați cu antigenul/anticorpul lor complementar.

          Imunodifuzie (unic) - O tehnică de difuzare a identității prin care produsul (antigenul) este plasat într-un puț tăiat într-un mediu, cum ar fi agar care conține anticorpul său complementar. Produsul se difuzează în mediu formând un precipitat în formă de inel a cărui densitate este o funcție a concentrației de antigen.

          Imunodifuzie (dublă, tehnica Ouchterlony) - O tehnică în care un antigen și un anticorp sunt plasate în două godeuri adiacente tăiate într-un mediu, cum ar fi agar. Pe măsură ce se difuzează prin mediu, formează linii de precipitații vizibile ale complexelor antigen / anticorp în punctul în care concentrațiile respective sunt la raportul optim pentru formarea latice.

          Cromatografia cu schimb de ioni (IEC) - O separare determinată de gradient bazată pe sarcina proteinei și afinitatea sa relativă pentru coloana vertebrală chimică a coloanei. Schimbul de anioni / cationi este frecvent utilizat pentru proteine.

          Focalizarea izoelectrică (IEF) - O metodă electroforetică care separă proteinele prin pI lor. Se deplasează printr-un mediu cu gradient de pH într-un câmp electric până când sunt localizați în punctul lor izoelectric, unde nu poartă nicio sarcină netă. Înainte de a-și atinge pI, mobilitatea proteinelor depinde, de asemenea, de dimensiune, conformație, înclinație a gradientului de pH și gradientul de tensiune. Această metodă este utilizată pentru a detecta forme incorecte sau modificate ale unei proteine, precum și impuritățile proteinelor.

          Limulus Amoebocyte Lysate Test (LAL) - Un test sensibil pentru prezența endotoxinelor folosind capacitatea endotoxinei de a provoca o reacție de coagulare în sângele unui crab potcoavă. Testul LAL este mai ușor, mai rapid, mai puțin costisitor și mult mai sensibil decât testul de iepure, dar poate detecta doar endotoxine și nu toate tipurile de pirogeni și, prin urmare, trebuie validat temeinic înainte de a fi utilizat pentru a înlocui testul USP Rabogen Pyrogen. Diferite forme ale testului LAL includ un test al cheagurilor de gel, un test colormetric, un test cromogen și un test turbidimetric.

          Spectrometrie de masă - O tehnică utilă în analiza structurii primare prin determinarea masei moleculare a peptidelor și proteinelor mici. Adesea utilizat cu maparea peptidelor pentru a identifica variantele din compoziția peptidică. Util pentru localizarea legăturilor disulfurice și pentru identificarea modificărilor post-traducere.

          Northern Blot - Tehnică pentru transferul fragmentelor de ARN dintr-un gel de agaroză într-un filtru de nitroceluloză pe care pot fi hibridizate la un ADN complementar.

          Peptide Mapping - O tehnică puternică care implică descompunerea proteinelor în peptide folosind enzime foarte specifice. Enzimele scindează proteinele în siturile de aminoacizi previzibile și reproductibile și peptidele rezultate sunt separate prin HPLC sau electroforeză. Un eșantion de hartă peptidică este comparat cu o hartă realizată pe un eșantion de referință ca etapă de confirmare a profilării identității unui produs. Este, de asemenea, utilizat pentru confirmarea legăturilor disulfidice, localizarea atașamentului carbohidraților, analiza secvenței și pentru identificarea impurităților și a degradării proteinelor.

          Reacția în lanț a polimerazei (PCR) - Tehnica in vitro de amplificare a acidului nucleic. Tehnica implică o serie de cicluri repetate de denaturare la temperatură ridicată, recoacere a grundului oligonucleotidic la temperatură scăzută și extindere a lanțului de temperatură intermediară. Acidul nucleic poate fi amplificat de un milion de ori după 25-30 de cicluri.

          Cuantificarea proteinelor - Cuantificarea cantității totale de proteine ​​se poate face printr-un număr de teste. Nu există o metodă care să fie mai bună decât restul, fiecare având propriile sale dezavantaje, de la cantitatea de proteine ​​necesare pentru a face testul până la o problemă cu variabilitatea între proteine. Unele dintre tipuri includ Lowry, acid bicinconic (BCA), Bradford, Biuret, Kjeldahl, spectroscopie ultravioletă.

          Secvențierea proteinelor - (vezi Secvențierea aminoacizilor).

          Testul pirogenului de iepure. U.S.P. - Un test pentru prezența pirogenilor (nu se limitează la endotoxine, așa cum este testul LAL) care implică injectarea materialului de testat la iepuri care sunt bine controlați și cu istoric cunoscut.Iepurii sunt apoi monitorizați pentru o creștere a temperaturii pe o perioadă de trei ore.

          Radioimmunoassay (RIA) - Un termen generic pentru imunotestele care au o etichetă radioactivă (etichetă) fie pe antigen, fie pe anticorp. Etichetele comune includ I125 și H3 care sunt utilizate pentru detectarea și cuantificarea testului. RIA clasice sunt teste de legare competitivă în care antigenul și antigenul marcat concurează pentru un număr limitat limitat de site-uri de legare pe anticorp. Complexul marcat legat de anticorp este invers proporțional cu concentrația antigenului.

          Cromatografie în fază inversă - O metodă de separare cromatografică bazată pe o fază staționară a coloanei acoperită pentru a da suprafață hidrofobă nepolară. Retenția analitelor este proporțională cu reacțiile hidrofobe dintre solut și suprafață. Retenția este aproximativ proporțională cu lungimea lanțului de carbon legat.

          SDS PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis) - O separare electroforetică a proteinelor pe baza greutăților lor moleculare. O sarcină negativă netă uniformă este impusă moleculelor prin adăugarea de SDS. În aceste condiții, migrarea către anod printr-o matrice de gel permite separarea prin dimensiune, nu prin încărcare, cu moleculele mai mici care migrează pe cea mai mare distanță. Această tehnică nu este fiabilă pentru dimensiuni sub un MW de cca. 8000.

          Proteinele sunt observate prin colorare albastră sau argintie Coomassie sau pot fi transferate în continuare în membrane pentru testarea specificității antigenului / anticorpului.

          Southern Blot - Tehnica de transfer de fragmente de ADN dintr-un gel de agaroza pe un filtru de nitroceluloza pe care pot fi hibridizate la un ADN complementar.

          Spectroscopie UV - O tehnică de cuantificare a proteinelor folosind spectrele lor distinctive de absorbție datorită prezenței cromoforilor din lanțul lateral (fenilalanină, triptofan și tirozină). Deoarece această absorbanță este liniară, proteinele foarte purificate pot fi cuantificate prin calcule folosind coeficientul lor de extincție molar.

          Western Blot - Acest test este utilizat pentru a detecta substraturile celulare contaminante și pentru a evalua polipeptidele recombinante. După separarea electroforetică, proteinele încărcate negativ (antigenele) sunt transferate electroforetic din gelul de poliacrilamidă pe o membrană de nitroceluloză poziționată pe partea anodă a gelului. După incubarea membranei cu un anticorp specific, acestea sunt marcate cu un alt anticorp pentru detectare.

          ORGANISM DE AVENTIȚIE - Bacterii, drojdie, mucegai, micoplasmă sau virusuri care pot contamina potențial celulele procariote sau eucariote utilizate în producție. Sursele potențiale de organisme adventive includ serul utilizat în mediul de cultură celulară, celulele infectate persistent sau latent sau mediul înconjurător.

          AFINITATE - Mărimea termodinamică care definește interacțiunea energetică sau legarea a două molecule, de obicei cea a anticorpului cu determinantul antigenic corespunzător.

          ANTICORPI (IMUNOGLOBULINĂ) - O moleculă proteică având o structură caracteristică formată din două tipuri de lanțuri peptidice: grele (H) și ușoare (L). Anticorpii conțin zone (loturi de legare) care se potrivesc în mod specific și se pot lega la locul său determinant corespunzător pe un antigen, care a indus producerea acelui anticorp de către limfocitele B și celulele plasmatice la o specie vie.

          ANTIGEN - Substanță, de obicei o proteină sau un carbohidrat străin, care atunci când este introdusă într-un organism, activează receptori specifici de la suprafața limfocitelor T și B imunocompetente. După interacțiunea dintre antigen și receptori, va exista de obicei inducerea unui răspuns imun, adică producerea de anticorpi capabili să reacționeze în mod specific cu siturile determinante de pe antigen.

          DETERMINANT ANTIGENIC - Partea specifică a unei structuri a unui antigen care va induce un răspuns imun, adică se va potrivi receptorilor de pe limfocitele T și B și va putea, de asemenea, să reacționeze cu anticorpii produși.

          ANTISER - Ser de sânge care conține anticorpi împotriva unui anumit antigen (sau imunogen). Aceasta înseamnă frecvent ser de la un animal care a fost inoculat cu antigenul.

          ASCITURI - Acumulări de lichid în cavitatea peritoneală. Anticorpii monoclonali pot fi purificați din ascita șoarecilor care poartă un hibridom transplantat.

          CONSTANȚĂ DE ASOCIERE - O reacție între anticorp și determinantul său care cuprinde o măsură a afinității. Constanta este cuantificată de constantele ratei legii acțiunii în masă pentru asociere și pentru disociere. AUTORADIOGRAFIE - Detectarea moleculelor marcate radioactiv pe film cu raze X.

          AVIDITATE - Puterea de legare totală între toate siturile de legare disponibile ale unei molecule de anticorp și determinanții corespunzători prezenți pe antigen.

          BACTERIOFAG – Un virus care atacă bacteriile. Bacteriofagul lambda este folosit frecvent ca vector în experimentele cu gene recombinante.

          SITE DE LEGAREA - Partea moleculei de anticorp care se va lega în mod specific de antigen.

          BIOACTIVITATE - Nivelul activității sau potenței specifice, determinat de modelul animal, cultura celulară sau testul biochimic in vitro.

          CONȚINERE BIOLOGICĂ - Caracteristicile unui organism care limitează supraviețuirea și / sau multiplicarea acestuia în mediu.

          MODIFICATOR DE RĂSPUNS BIOLOGIC - Termen generic pentru hormoni, compuși neuroactivi și compuși imunoreactivi care acționează la nivel celular mulți sunt posibili candidați pentru producția biotehnologică.

          BIOREACTOR - Un vas în care au loc reacțiile centrale ale unui proces biotehnologic. De obicei, vasul conține microbi crescuți în condiții controlate de temperatură, aerare, amestecare, aciditate și sterilitate.

          BIOSENZORI - Sistemele puternice de recunoaștere a substanțelor chimice biologice (enzime, anticorpi, ADN) sunt cuplate cu microelectronica pentru a permite detectarea rapidă și precisă la nivel scăzut a unor substanțe precum zaharurile și proteinele (cum ar fi hormonii) din fluidele corporale, poluanții din apă și gaze. în aer.

          CALIBRATOR - Un termen din chimia clinică care se referă în mod obișnuit la standardul folosit pentru „calibrarea” unui instrument sau utilizat în construcția unei curbe standard (calibrator).

          CULTURA CELULARĂ - Creșterea in vitro a celulelor izolate din organisme multicelulare. Aceste celule sunt de obicei de un singur tip.

          DIFERENȚIEREA CELULARĂ - Procesul prin care descendenții unei celule parentale comune realizează și mențin specializarea structurii și funcției.

          FUZIUNEA CELULARĂ - Formarea unei celule hibride cu nuclei și citoplasmă din celule diferite, produsă prin fuzionarea a două celule din aceeași specie sau specii diferite.

          LINEA CELULARĂ - Celulele care dobândesc capacitatea de a se multiplica la nesfârșit in vitro.

          CHEMOTAXIS - Mișcare orientată net într-un gradient de concentrație a anumitor compuși. Diferite zaharuri și aminoacizi pot servi ca substanțe atractive, în timp ce unele substanțe, cum ar fi acidul sau alcalinele, servesc drept repelenți în chimiotaxia microbiană. Celulele albe din sânge și macrofagele demonstrează mișcare chimiotactică în prezența produselor bacteriene, proteine ​​complementare și celule T activate de antigen pentru a contribui la reacția inflamatorie locală și la rezistența la agenți patogeni.

          CISTRON - Cea mai mică unitate de material genetic care este responsabilă pentru sinteza unei polipeptide specifice.

          CLONĂ - O linie celulară care provine dintr-o singură celulă ancestrală și care exprimă în mod normal toate aceleași gene. Dacă aceasta este o clonă a limfocitelor B, acestea vor produce în mod normal anticorpi identici, adică anticorpi monoclonali.

          CODON - Grup de trei baze nucleotidice din ADN sau ARN care determină compoziția unui aminoacid în „construirea” unei proteine ​​și, de asemenea, poate codifica terminarea lanțului.

          TERMINII COEZIVE - moleculă de ADN cu capete monocatenar cu baze complementare expuse (coezive).

          ADN COMPLEMENTAR (ADNc) - ADN care este complementar ARN-ului mesager utilizat pentru clonare sau ca sondă în studiile de hibridizare ADN.

          COSMID - Un vector care este similar cu o plasmidă, dar conține și siturile de coeziune (sit cos) ale bacteriofagului lambda pentru a permite inserarea unor fragmente mari de ADN și ambalarea in vitro într-un fag.

          REACȚIE CRUZATĂ - Anticorpii împotriva unui antigen A pot reacționa cu alți antigeni dacă acesta din urmă are unul sau mai mulți determinanți în comun cu determinanții prezenți pe antigenul A sau poartă unul sau mai mulți determinanți care sunt structural foarte asemănători cu determinanții prezenți pe antigenul A.

          CITOKINE - Proteine ​​mici, non-imunoglobuline produse de monocite și limfocite care servesc ca comunicatori intercelulari după legarea de receptori specifici de pe celulele care răspund. Citokinele reglează o varietate de activități biologice.

          EFECT CITOPATIC - Modificări morfologice ale liniilor celulare produse atunci când celulele sunt infectate cu un virus. Exemple de efecte citopatice includ rotunjirea și aglomerarea celulelor, fuziunea membranelor celulare, mărirea sau alungirea celulelor sau liza celulelor.

          CITOTOXIC - Daune celulelor.

          DENATURAREA - Desfăşurarea unei molecule de proteine ​​într-o formă în general bio-inactivă. De asemenea, întreruperea duplexului ADN în două catene separate.

          ADN (ACID DEOXIRIBONUCLEIC) - Componenta biochimica de baza a cromozomilor si suportul ereditatii. ADN-ul conține dezoxiriboză de zahăr și este acidul nucleic în care sunt stocate informațiile genetice (în afară de unele virusuri).

          CLONAREA ADN-ului - Producerea a numeroase copii identice ale unui fragment de ADN definit.

          BIBLIOTECA ADN - Set de fragmente de ADN clonat care împreună reprezintă întregul genom sau transcripția unui anumit țesut.

          ADN-POLIMERAZA - O enzimă care catalizează sinteza ADN-ului dublu catenar din ADN-ul monocatenar.

          SINTEZA ADN-ului - Formarea ADN-ului prin adăugarea secvențială a bazelor nucleotidice.

          DNază - O enzimă care produce ciocnituri monocatenare în ADN. DNase este utilizat în traducerea nick.

          ELUȚIE - Îndepărtarea materialului adsorbit dintr-un adsorbant, cum ar fi îndepărtarea unui produs dintr-o enzimă legată pe o coloană.

          ENDONULEAZE - Enzime care scindează legături în moleculele de acid nucleic.

          ENDOTOXINA - O lipopolizaharidă stabilă la căldură asociată cu membrana exterioară a anumitor bacterii gram-negative. Nu este secretat și este eliberat doar atunci când celulele sunt perturbate. Când sunt injectate la oameni, endotoxinele produc un răspuns febril, ducând la probleme clinice severe, inclusiv moartea. O unitate de endotoxină (UE) este definită în comparație cu actualul standard de referință USP Lot EC- 5. Un flacon al lotului EC-5 conține 10.000 UE. Testul oficial pentru endotoxină se găsește în USP.

          ENZIME - Proteine ​​care acționează ca un catalizator în reacțiile biochimice.

          EXONUCLEASES - Enzime care catalizează îndepărtarea nucleotidelor de la capetele unei molecule de ADN.

          FERMENTARE - Un bioproces anaerob. Fermentarea este utilizată în diverse procese industriale pentru fabricarea produselor precum alcooli, acizi și brânză prin acțiunea drojdiilor, mucegaiurilor și bacteriilor. Procesul de fermentare este utilizat și în producția de anticorpi monoclonali.

          FUZIUNEA PROTOPLASTELOR - Fuziunea a două celule ai căror pereți au fost eliminați, făcând posibilă redistribuirea moștenirii genetice a microorganismelor.

          GENE - Unitatea de bază a eredității, care joacă un rol în exprimarea unei caracteristici specifice. Expresia unei gene este mecanismul prin care informațiile genetice pe care le conține sunt transcrise și traduse pentru a obține o proteină. O genă este o parte a moleculei de ADN care conduce sinteza unui lanț polipeptidic specific. Este compus din mulți codoni. Atunci când gena este considerată ca o unitate de funcționare în acest mod, termenul cistron este adesea folosit.

          TRANSFER GENIC - Utilizarea manipulării genetice sau fizice pentru a introduce gene străine într-o celulă gazdă pentru a atinge caracteristicile dorite în descendenți.

          INGINERIE GENETICĂ - O tehnică utilizată pentru a modifica informațiile genetice dintr-o celulă vie, reprogramând-o pentru un scop dorit (cum ar fi producerea unei substanțe pe care nu ar produce-o în mod natural).

          GENOM - Toate genele purtate de o celulă.

          GLICOPROTEINĂ - Proteină de care se atașează grupuri de zaharuri. Proteinele grupului sanguin uman, proteinele peretelui celular și unii hormoni sunt exemple de glicoproteine.

          GLICOSILARE - atașarea covalentă a zaharurilor la un aminoacid din porțiunea proteică a unei glicoproteine.

          HAPTEN - O substanță cu greutate moleculară mică care singură poate reacționa cu anticorpul corespunzător. Pentru a fi imunogene, haptenele sunt legate de molecule cu greutăți moleculare mai mari de 5000. Un exemplu ar fi hapten digoxina legată covalent de albumina serică bovină, formând imunogenul digoxină-BSA.

          ANTICORP DE AFINITATE MARE - Anticorpi cu afinitate mare pentru antigen. Acești anticorpi sunt predominant IgG și sunt produși în timpul unui răspuns secundar la antigen. Celulele care produc un anticorp cu afinitate ridicată pot fi declanșate de o concentrație scăzută de antigen.

          CROMATOGRAFIE LICHIDĂ DE ÎNALTĂ PERFORMANȚĂ (HPLC SAU LC) - (Vezi Metode de testare)

          HOST - O celulă al cărei metabolism este utilizat pentru creșterea și reproducerea unui virus, plasmidă sau altă formă de ADN străin.

          TEHNOLOGIA HIBRIDOMULUI - Fuziunea dintre o celulă care formează anticorpi (limfocit) și o celulă de mielom malign ("nemuritoare"), care va avea ca rezultat o clonă celulară în creștere continuă (hibridom), care poate produce anticorpi cu o singură specificitate.

          SPECIFICITATEA IMUNOASAY - O caracteristică de performanță determinată prin efectuarea de studii de reactivitate încrucișată cu substanțe structurale similare care pot fi prezente în matricea analitului. Studiile de specificitate sunt determinate cu fiecare nou lot de anticorpi policlonali utilizați în imunotest. Pentru anticorpul monoclonal, fiecare lot nou ulterior este de obicei caracterizat prin tehnici biochimice și biofizice în locul studiilor complete de specificitate.

          IMUNOELECTROFORESIE (IEP) - (Vezi Metode de testare - Imunodifuzie (tehnici duble, Ouchterlony))

          IMMUNOTOXINA - Anticorpi monoclonali cuplați cu toxine care sunt capabili să livreze porțiunea toxină către o celulă țintă.

          HIBRIDARE IN SITU - Hibridarea cu o sondă adecvată efectuată direct pe un preparat cromozomal sau secțiune histologică.

          IN VITRO - Reacții biologice care au loc în afara corpului într-un sistem artificial.

          IN VIVO - Reacție biologică care are loc în interiorul unei celule sau organism viu.

          INDUCER - O schimbare chimică sau condițională care activează expresia care duce la producerea unui produs dorit. O moleculă mică care interacționează cu o proteină regulatoare și declanșează transcrierea genei.

          LIGAZĂ - Enzimă utilizată pentru a uni moleculele de ADN.

          LOCUS - Locul unei gene pe un cromozom.

          LIMFOKINE - Substanțe eliberate predominant din limfocitele T după reacția cu antigenul specific. Limfokinele sunt biologic foarte active și vor provoca chimiotaxie și activarea macrofagelor și a altor reacții imune mediate de celule. Gamma-interferonul este o limfokină.

          LIZA - Procesul prin care are loc o defalcare a peretelui celular, eliberând conținutul celular în mediul înconjurător. Distrugerea bacteriilor de către fagi infecțioși.

          MASTER CELL BANK (MCB) - Un lot de semințe celulare constând din alicote ale unei singure culturi (în majoritatea cazurilor, extinse dintr-o singură celulă) și stocate criogenic pentru a asigura stabilitatea genetică. Ar trebui să existe suficiente fiole de MCB pentru a furniza materialul sursă pentru o bancă de semințe funcțională.

          ARN MESSENGER (ARNm) - ARN care servește ca șablon pentru sinteza proteinelor, transportă codul genetic transcris de la ADN la complexul de sinteză a proteinelor pentru a direcționa sinteza proteinelor.

          MICROHETEROGENEITATE - Ușoare diferențe între macromolecule mari și complexe care au ca rezultat o populație de structuri strâns legate, dar nu identice. Microheterogenitatea proteinelor poate apărea din mai multe surse: variante genetice, activitate proteolitică în celule, în timpul translației în proteine, în timpul atașării zaharurilor și în timpul producției comerciale.

          ANTICORPI MONOCLONALI - Anticorpi produși de o clonă celulară și toți identici.

          MUTAGENEZĂ - Inducerea mutației genetice prin mijloace fizice sau chimice pentru a obține o caracteristică dorită de cercetători.

          MUTAȚIE - O modificare a materialului genetic, fie a unei singure perechi de baze (mutație punctuală), fie a numărului sau structurii cromozomilor.

          MIELOM - Linie celulară tumorală derivată dintr-un limfocit.

          TRADUCERE NICK - Metoda in vitro utilizată pentru a introduce nucleotide marcate radioactiv în ADN.

          NICK - O ruptură în coloana vertebrală zahăr-fosfat a unui fir ADN sau ARN.

          OLIGONUCLEOTIDE - Segmente scurte de ADN sau ARN, adică un lanț de câteva nucleotide.

          GEN OPERATOR - O genă care activează gena (structurile) structurală (e) adiacentă (e).

          OPERON - Unitate completă de expresie genică bacteriană constând dintr-o genă (regulatoare) regulatoare, elemente de control (promotor și operator) și gene (structuri) adiacente.

          PATOGEN - Un agent producător de boli, de obicei limitat la un agent viu, cum ar fi o bacterie sau un virus.

          LEGĂTURA PEPTIDICĂ - Legătură chimică între gruparea carboxil (- COOH) a unui aminoacid și gruparea amino (- NH2) a altuia.

          PLACA - Zona curata intr-o cultura bacteriana placata datorita lizei de catre un fag.

          PLASMID - Un segment circular extracromozomial, autoreplicabil, de plasmide ADN (și unele viruși) sunt utilizați ca „vectori” pentru donarea ADN-ului în celulele „gazdă” bacteriene.

          POLICLONAL - Derivat din diferite tipuri de celule.

          PROCARIOT - Un organism (de exemplu, bacterie, virus, alge albastre-verzi) al cărui ADN nu este închis într-o membrană nucleară.

          PROTEINE - O polipeptidă formată din aminoacizi. În stările lor biologic active, proteinele funcționează ca catalizatori în metabolism și, într-o oarecare măsură, ca elemente structurale ale celulelor și țesuturilor.

          PIROGENICITATE - Tendința ca unele celule bacteriene sau părți ale celulelor să provoace reacții inflamatorii în organism, care le pot diminua utilitatea ca produse farmaceutice.

          ADN RECOMBINANT - ADN care conține gene din diferite surse care au fost combinate prin metode de inginerie genetică spre deosebire de experimentele tradiționale de reproducere.

          HARTĂ DE RESTRICȚIE - Dispunerea liniară a diferitelor situsuri de enzime de restricție.

          SITE DE RESTRICȚIE - Secvența de bază recunoscută de o enzimă.

          RETROVIRUS - virus ARN care se reproduce prin conversie într-un duplex ADN.

          TRANSCRIPTASA INVERSĂ - O enzimă care catalizează sinteza ADN-ului din ARN.

          ARN (ACID RIBONUCLEIC) - Componentă biochimică de bază a cromozomului care se găsește în principal în nucleol și ribozomi. ARN Messenger transferă informații genetice de la nucleu la ribozomi din citoplasmă și acționează, de asemenea, ca un model pentru sinteza polipeptidelor. Transferul ARN transferă aminoacizii activi din citoplasmă în ARN mesager.

          ARN POLIMERAZĂ - O enzimă care catalizează sinteza ARN în transcripție.

          ELECTROPOREZE DE GEL POLIACRILAMID SULFAT DE SODIU DE DODECIL (SDS-PAGE) (A se vedea metodele de testare)

          TULINA - Un grup de organisme din aceeași specie având caracteristici distinctive, dar care nu sunt de obicei considerate o rasă sau un soi separat.

          CELULE T-HELPER - Limfocite T cu capacitate specifică de a ajuta alte celule, cum ar fi limfocitele B, să producă anticorpi. Celulele T-helper sunt, de asemenea, necesare pentru inducerea altor activități limfocitelor T. Sinonimul este celulă inductoare T, celule T4 sau limfocite CD 4.

          CELULE T-SUPPRESSOR - Limfocite T cu capacitate specifică de a inhiba funcția celulelor T-helper.

          TRANSCRIPȚIA - Prima etapă în exprimarea unei gene prin intermediul informațiilor genetice transmise de la ADN-ul din cromozomi la ARN-ul mesager.

          TRADUCERE - A doua etapă în exprimarea unei gene prin intermediul informațiilor genetice transmise de la ARNm la sinteza proteinelor.

          VECTOR - O plasmidă, fag sau cosmid în care ADN-ul străin poate fi inserat pentru clonare.

          BLOT DE VEST - (Vezi Metode de testare).

          WORKING CELL BANK (WCB) - O cantitate de celule derivate din una sau mai multe fiole din Master Cell Bank și utilizate pentru inițierea lotului de producție.


          Apendice

          Servicii de laborator

          Următoarele numere de servicii de laborator per ciclu sunt considerate necesare din punct de vedere medical.

          Tabel: Servicii de laborator pe ciclu
          Monitorizarea naturală Monitorizare clomid Clomid IUI Ciclul Inj Mon Inj IUI FIV CADOU Cod FET P.M
          Ecografie transvaginală 2 6 6 8 10
          Estradiol 2 6 6 8 10 10 10 10
          FSH 2 6 6 8 10 10 10 10
          LH 2 6 6 8 10 10 10 10
          Progesteron 2 note de subsol pentru progesteron * 2 note de subsol pentru progesteron * 2 note de subsol pentru progesteron * 8 10 10 10 10 3
          hCG 2 2 2 2 2 2 2 2 3

          Cheie: IUI: inseminare intra-uterină Inj: injecție Luni: FIV lunar: fertilizare in vitro CADOU: transfer gamet intra-uterin FET: transfer embrion congelat PM: monitorizarea sarcinii FSH: hormon foliculostimulant LH: hormon luteinizant hCG: gonadotropină corionică umană .

          Note de subsol pentru progesteron *Notă: Peste 2 măsurători ale progesteronului pot fi necesare din punct de vedere medical pentru femeile infertile cu cicluri menstruale neregulate și prelungite. Pentru femeile infertile cu cicluri menstruale regulate, o măsurare a progesteronului seric la mijlocul luteal (ziua 21 a unui ciclu de 28 de zile) este considerată necesară din punct de vedere medical. Pentru femeile infertile cu cicluri menstruale neregulate, acest test ar trebui repetat în faza luteală mijlocie și apoi săptămânal până la începerea următorului ciclu menstrual.

          Gonadotropine / Menotropins (ciclul inițial Note de subsol pentru ciclul inițial *)

          Cu vârsta mai mică de 35 de ani: 20 de fiole (până la 35 de fiole dacă nivelul FSH este mai mare de 12 și mai mic de 19)

          Vârsta de la 35 la 39 de ani: 20 la 30 de fiole (până la 40 de fiole dacă nivelul FSH este mai mare de 12 și mai mic de 19)

          Vârsta de 40 de ani și peste: 40 de fiole (până la 50 de fiole dacă nivelul FSH este mai mare de 12 și mai mic de 19)

          Cu vârsta mai mică de 35 de ani: 30 până la 40 de fiole (până la 50 de fiole dacă nivelul FSH este mai mare de 12 și mai mic de 19)

          Vârsta 35 - 39 ani: 35 - 45 fiole (până la 55 fiole dacă FSH este mai mare de 12 și mai mică de 19)

          Vârsta de 40 de ani și peste: 45 până la 60 de fiole (cererile pentru mai mult de 60 de fiole sunt supuse revizuirii clinice dacă nivelul FSH este mai mare de 12 și mai mic de 19, solicitați protocolul de medicație și revizuirea clinică (IMC, PCOS))

          Ouă donatoare Note de subsol pentru ouă donatoare ** (toate vârstele): 30 până la 40 fiole (până la 50 fiole dacă nivelul FSH este mai mare de 12 și mai mic de 19)

          Hormon luteinizant (ciclul inițial Note de subsol pentru ciclul inițial *)

          Cu vârsta mai mică de 35 de ani: 1 până la 10 fiole

          Vârsta 35 până la 39 de ani: 10 până la 15 fiole

          Vârsta de 40 de ani și peste: 15 până la 20 de fiole

          Mai puțin de 35 de ani: 10 fiole

          Vârsta 35 - 39 ani: 10 - 20 fiole

          Vârsta de 40 de ani și peste: 20 până la 30 de fiole

          Injecții subcutanate cu HCG (Note de subsol pentru ciclul inițial *)

          Injecții intramusculare cu HCG (Note de subsol pentru ciclul inițial *)

          Cheie: ART: tehnologie reproductivă avansată IMC: indice de masă corporală FSH: hormon foliculostimulant HCG: gonadotropină corionică umană UI: unități internaționale MDV: flacon cu doză multiplă PCOS: sindrom ovarian polichistic PFS: seringă preumplută U: unități.

          Note de subsol pentru ciclul inițial * Reumplere bazate pe documentația din foile de ciclu.

          Note de subsol pentru ouă donatoare ** Unele planuri exclud serviciile de infertilitate pentru insuficiența ovariană, vă rugăm să verificați descrierile planului de beneficii.

          Note de subsol pentru cantitatea de inseminare † Presupune că ciclul de inseminare intra-uterin utilizează medicamente timp de 10 zile

          Note de subsol pentru Cantitatea ART ‡ Se presupune că ciclul ART utilizează medicamente timp de 10 zile.

          Note de subsol pentru exemple § Pentru concentrații diferite, utilizați 75 UI ca bază.

          Nume de marcă

          Durata aprobării

          450 unități MDV, 1050 unități MDV

          150, 300, 600, 900 cartușe cu mai multe doze

          După normalizarea nivelurilor serice de testosteron, utilizați Gonal F concomitent cu hCG: 150 de unități de trei ori pe săptămână, doză maximă de 300 de unități de trei ori pe săptămână timp de până la 18 luni

          După normalizarea nivelului seric de testosteron, utilizați Follistim AQ concomitent cu hCG: 450 de unități pe săptămână (sau 225 de unități de două ori pe săptămână sau 150 de unități de trei ori pe săptămână).

          injecții intramusculare hCG

          Exemple: Pregnyl, Novarel, hCG

          500-1000 de unități de trei ori pe săptămână x 3 săptămâni urmate de aceeași doză de două ori pe săptămână x 3 săptămâni

          4000 de unități de trei ori pe săptămână timp de 6-9 luni, după care doza poate fi redusă la 2000 de unități de trei ori pe săptămână pentru încă 3 luni

          Note de subsol pentru folitropină * Terapia concomitentă cu folitropină recombinată și gonadotropină corionică umană trebuie continuată timp de cel puțin 3 până la 4 luni înainte de a se putea aștepta îmbunătățirea spermatogenezei.

          Definiții

          În scopul acestei politici, vor fi utilizate următoarele definiții:

          Clasificarea tulburărilor ovulatorii:

          Anovulația și oligo-ovulația sunt tulburări ovulatorii care se estimează că provoacă 21% din problemele de fertilitate feminină. Organizația Mondială a Sănătății clasifică tulburările de ovulație în 3 grupe.

          Grupa I:
          Grupa II:
          Grupa III:

          Calitatea embrionilor în ciclurile ART:

          Un embrion este considerat a fi de calitate rezonabilă (gradul B sau echivalentul său) dacă are o fragmentare mai mică de 50% (a se vedea, de exemplu, Ebner, și colab., 2001 Rhenman, și colab., 2015 Shaw-Jackson, și colab. , 2013)..

          Ratele de fertilizare în ciclurile FIV:

          Ratele de fertilizare sunt considerate slabe dacă ciclurile FIV au ca rezultat o fertilizare mai mică de 50%.

          Rezerva ovariană ca răspuns la stimularea gonadotropinei:

          Rezerva ovariană este considerată normală dacă se dezvoltă 3 sau mai mulți foliculi și nivelurile de estrogen sunt mai mari de 500 mUI/ml după hiperstimularea ovariană cu gonadotropine. Rezerva ovariană diminuată este indicată de nivelurile maxime de estrogen mai mici de 500 mIU / ml sau mai puțin de 3 foliculi maturi sunt disponibili în momentul stimulării și recuperării.

          Calitatea și cantitatea materialului seminal:

          Deficitele în cantitatea de material seminal sunt considerate severe dacă există mai puțin de 10 milioane de spermatozoizi mobili totali per ejaculat (probă nespălată) sau mai puțin de 3 milioane de spermatozoizi mobili totali (probă spălată) în 2 ocazii separate, la cel puțin 2 săptămâni între ele. Deficiențele de calitate a materialului seminal sunt considerate severe dacă există mai puțin de 4% forme normale care utilizează morfologia strictă Kruger. La bărbații care au îndeplinit definiția infertilității severe a factorilor masculini cu o calitate sau o cantitate anormală a spermei la mai mult de 2 săptămâni distanță în trecut și care au avut apoi o varicocelectomie de succes, rezultând o calitate sau o cantitate normală de spermă, ICSI este considerat a nu fi necesar din punct de vedere medical.

          Analiza materialului seminal: Valori de referință ale Organizației Mondiale a Sănătății
          • pH: 7,2 sau mai mult
          • Concentrația spermei: 15 milioane de spermatozoizi pe ml sau mai mult
          • Morfologia spermei (procentul formelor normale): 4% sau mai mult
          • Volumul spermei: 1,5 ml sau mai mult
          • Motilitate totală (procent de motilitate progresivă și motilitate neprogresivă): 40 % sau mai mult mobil sau 32 % sau mai mult cu motilitate progresivă
          • Numărul total de spermatozoizi: 39 de milioane de spermatozoizi per ejaculat sau mai mult
          • Vitalitate: 58% sau mai mulți spermatozoizi vii
          Etapele endometriozei

          Chirurgical, endometrioza poate fi în stadii I-IV (Clasificarea revizuită a Societății Americane de Medicină Reproductivă). Diferitele etape arată aceste constatări:

          Etapa I (minimal) -

          Etapa II (Ușoară) -

          Etapa a III-a (moderată) -

          Etapa IV (severă) -

          Sursa: Adaptat din ASRM, 1997.


          Utilizarea ARNi ca instrument preliminar pentru screeningul receptorilor putativi ai toxinelor nematicide din Bacillus thuringiensis

          Bacillus thuringiensis este un potențial agent de control pentru nematodele plante-parazite. Receptorii intestinali nematozi pentru toxinele de tip Cry21 sunt puțin cunoscuți. Prin urmare, o strategie a fost testată ca instrument principal de screening pentru a găsi posibili receptori ai toxinei Cry, folosind o tulpină nematicidă de Bt și tehnica RNAi pe Caenorhabditis elegans. Au fost selectate șase gene care codifică proteinele membranei intestinale (abt-4, bre-1, bre-2, bre-3, asps-1, abl-1) ca ținte posibile pentru proteinele Cry. Fracțiile din fiecare genă selectată au fost amplificate prin PCR. Ampliconii au fost clonați în vectorul L4440 pentru a transforma E coli Tulpina HT155 (DE3). Bacteriile transformate au fost folosite pentru a reduce la tăcere genele selectate folosind metoda de hrănire RNAi. Nematozii cu gene reduse la tăcere au fost testați cu tulpina Bt LBIT-107, care găzduiește proteina nematicidă Cry21Aa3, printre altele. Rezultatele au indicat că nematozii cu tăcere aproximativ-4 genele au fost cu 69,5% mai rezistente la tulpina LBIT-107, în general, și cu 79% la toxina Cry21Aa3, în mod specific.

          Aceasta este o previzualizare a conținutului abonamentului, acces prin intermediul instituției dvs.


          Concluzii

          Selectarea gARN-urilor pentru un experiment trebuie să echilibreze maximizarea activității la țintă, reducând în același timp activitatea în afara țintei, care sună evident, dar poate necesita adesea decizii dificile. De exemplu, ar fi mai bine să utilizați un gARN mai puțin activ care vizează un site cu adevărat unic în genom sau un gARN mai activ cu un site țintă suplimentar într-o regiune a genomului fără funcție cunoscută? Pentru crearea de modele de celule stabile care urmează să fie utilizate pentru studii pe termen lung, primul poate fi alegerea mai bună. Pentru ca o bibliotecă la nivelul întregului genom să conducă ecrane genetice, totuși, o bibliotecă compusă din acesta din urmă ar fi probabil mai eficientă, atâta timp cât se acordă atenție interpretării rezultatelor, necesitând mai multe secvențe care vizează o genă să înscrie pentru a numi asta genă o lovitură.

          Acesta este un moment interesant pentru genomica funcțională, cu o listă în continuă extindere de instrumente pentru a sonda funcția genelor. Cele mai bune instrumente sunt la fel de bune ca și persoana care le folosește, iar utilizarea corectă a tehnologiei CRISPR va depinde întotdeauna de o proiectare, execuție și analiză experimentală atentă.

          Multe mulțumiri bloggerului nostru invitat John Doench!

          John Doench este director de cercetare și dezvoltare în Platforma de perturbare genetică la Broad Institute și a lucrat cu mulți Addgenies pentru a ajuta la îmbunătățirea înțelegerii, gestionării și explicației resurselor noastre CRISPR. Îi plac foarte mult ARN-urile mici.


          Priveste filmarea: Oprettelse af Database og Tabel med Data (Ianuarie 2022).