Informație

Cum să alegi volumul corect de ADN și SYBR Green


Testez nivelul de fluorescență al unei probe care are dsDNA, SYBR Green și milli q apă, dar mă confrunt cu dificultăți în a alege volumul corect de dsDNA și nivelul contra de SYBR Green.

Detalii despre eșantion: dsDNA:1000 nano mol, SYBR Green:1X (diluat de 1000 de ori din stocul original)

Exemplu_1: dsDNA (3ul) + SYBR Green (5ul) + milli q water (27ul)

Exemplu_2: dsDNA (3ul) + SYBR Green (5ul)

Rezultat: În prima probă nu am primit niciun semnal, dar în al doilea caz am primit (Dar vreau de 5 ori mai mare decât am primit).

Vă rog să-mi spuneți cum funcționează și cum depind unele de altele aceste lucruri. Nu sunt biolog, dacă este posibil, sugerează-mi și resurse.


A trebuit să-l caut online, dar în cele din urmă am găsit aici o informație importantă: limitele de detecție ale SYBR Green.

dsADN la transiluminare de 300 nm: 60 pg
Oligonucleotide la transiluminare de 300 nm 1-2 ng

Mai întâi, ar trebui să verificați dimensiunea ADN-ului dvs. de interes și, din dimensiunea acestuia, aflați greutatea moleculară aproximativă (de exemplu, utilizând acest calculator online). Apoi, ar trebui să verificați dacă 1000 nmoli de ADN corespunde unei mase mai mari de 60 pg. Dacă nu, ar trebui să creșteți cantitatea de ADN din test în consecință până când masa introdusă în test depășește limita de detectare a SYBR Green.

Acum, știi concentrația ADN-ului tău? Cu alte cuvinte, cum ați ales să utilizați 3 uL de ADN? De unde știi că aceste 3 uL conțin suficient material? (1000 nmoli ca în protocolul dvs. sau mai bine, că acesta este mai mare decât limita de detecție în termeni de masă).

De asemenea, ați utilizat soluția stoc 1000X de SYBR Green fără diluare intermediară? Dacă da, concentrația finală de SYBR Green este mult mai mare decât 1X final pe care îl doriți, în ambele probe:

  1. proba 1: 5 uL de 1000X SYBR Verde într-un volum total de 3 + 5 + 27 = 35 uL înseamnă că concentrația finală este 1000X * 5/35 = ~ 143X.
  2. proba 2: 5 uL de 1000X SYBR Verde într-un volum total de 3 + 5 = 8 uL înseamnă că concentrația finală este 1000X * 5/8 = 625X.

Ceea ce aveți nevoie este fie să utilizați 1 uL de soluție stoc 1000X de SYBR Green + orice cantitate de ADN care va fi peste limita de detecție + tampon pentru a regla volumul la 1000 uL final (ceea ce va aduce SYBR Green la 1X final), fie faceți o diluare intermediară adecvată a SYBR Green, astfel încât concentrația sa finală să fie de 1X, urmând prepararea probei, așa cum este descris în întrebarea dvs.

Pregătirea eșantionului pe care o descrieți aici produce o compoziție care este departe de cea sugerată de protocolul dvs., cel puțin pentru SYBR Green. Până nu încercați din nou cu concentrații finale adecvate, nu concluzionați că nu a funcționat. :-)

Mult succes cu proiectul tau.


PCR Master Mixes și Supermixes

Un amestec principal PCR este o soluție concentrată preamestecată care are toate componentele pentru o reacție PCR în timp real care nu sunt specifice probei. Un amestec principal conține de obicei o ADN polimerază termostabilă, dNTP, MgCl2, și aditivi proprietari într-un tampon optimizat pentru PCR. Doar șablonul, grundurile, sondele (dacă sunt utilizate) și apa, pentru a alcătui volumul, trebuie adăugate. Pot fi incluși unul sau mai mulți coloranți pentru detectarea fluorescentă a formării produsului în PCR cantitativă în timp real (qPCR).

Supermixurile Bio-Rad pentru PCR în timp real sunt mixuri master extrem de proiectate optimizate pentru o gamă largă de aplicații PCR, qPCR și transcripție inversă qPCR (RT-qPCR), cu formulări tampon proprietare și enzime avansate, cum ar fi polimeraza de fuziune Sso7d brevetată. Supermixurile noastre oferă viteză superioară, specificitate, sensibilitate și toleranță la inhibitorul PCR, chiar și cu cele mai provocatoare șabloane și secvențe țintă.


MATERIALE ȘI METODE

Purificarea ADN-ului

ADN cromozomal din Campylobacter jejuni ( C. jejuni ) tulpina de tip CCUG-11284 a fost izolată folosind o metodă descrisă de Machiels et al. [25] cu modificări [26]. ADN-ul a fost eluat în 100 μl de apă sterilă preîncălzită [65°C]. Concentrațiile de ADN au fost determinate la OD 260 nm folosind un spectrofotometru (Ultrospec 2000, Pharmacia Biotech, Cambridge, Marea Britanie). Preparatele ADN au fost depozitate la -20°C înainte de utilizare.

Grundele și condițiile PCR

Secvențele de grund și condițiile PCR utilizate în acest studiu sunt rezumate în Tabelul 1 și au fost descrise anterior [27]. Lungimea ampliconilor PCR și conținutul GC au fost obținute din baza de date NCBI Genbank. Două seturi de grund, UB-FW / UB-RW și UC-FW / UC-RW au fost utilizate pentru a amplifica fragmente de 300 bp (51,5% GC) și 144 bp (54,9% GC) ale genei 16S rRNA. Un al treilea set de grund HIP-FW / și HIP-RW a fost utilizat pentru a amplifica un fragment de 149 bp (37,3% GC) din hipuricază gena de C. jejuni .

Secvențe primare ale celor trei produse PCR utilizate în studiu și lungimea corespunzătoare a produsului PCR obținute din baza de date NCBI

Grund . Secvență. PCR amplicon [NC_003912]. % Conținut GC. Tm calculat de cel mai apropiat vecin [° C].
UB-FW 5′-GCTAA CTCCGTG CCAGCAG CCGCGG-3 ′ 307 bp 51 85
UB-RW 5′-GGGCG TGGACTA CCAGGG TATC-3 ′
UC-FW 5′-CCGC AACGAGC GCAACC CACG-3′ 144 bp 55 84
UC-RW 5′-CATT GTAGC ACGTGT GTC-3 ′
HIP-FW 5′-GTACT GCAAAA TTAGT GGCG-3 ′ 148 bp 35 78
HIP-RW 5′-GCAA GGCAAA GCATC CATA-3′
Grund . Secvență. PCR amplicon [NC_003912]. % Conținut GC. Tm calculat de cel mai apropiat vecin [°C] .
UB-FW 5′-GCTAA CTCCGTG CCAGCAG CCGCGG-3′ 307 bp 51 85
UB-RW 5′-GGGCG TGGACTA CCAGGG TATC-3 ′
UC-FW 5′-CCGC AACGAGC GCAACC CACG-3′ 144 bp 55 84
UC-RW 5′-CATT GTAGC ACGTGT GTC-3 ′
HIP-FW 5′-GTACT GCAAAA TTAGT GGCG-3 ′ 148 bp 35 78
HIP-RW 5′-GCAA GGCAAA GCATC CATA-3′

Secvențele de primer ale celor trei produse PCR utilizate în studiu și lungimea produsului PCR corespunzătoare, obținută din baza de date NCBI

Grund . Secvență. PCR amplicon [NC_003912]. Conținut GC% . Tm calculat de cel mai apropiat vecin [° C].
UB-FW 5′-GCTAA CTCCGTG CCAGCAG CCGCGG-3′ 307 bp 51 85
UB-RW 5′-GGCGG TGGACTA CCAGGG TATC-3′
UC-FW 5′-CCGC AACGAGC GCAACC CACG-3 ′ 144 bp 55 84
UC-RW 5′-CATT GTAGC ACGTGT GTC-3 ′
HIP-FW 5′-GTACT GCAAAA TTAGT GGCG-3′ 148 bp 35 78
HIP-RW 5′-GCAAA GGCAAA GCATC CATA-3 ′
Grund . Secvență. PCR amplicon [NC_003912]. % Conținut GC. Tm calculat de cel mai apropiat vecin [° C].
UB-FW 5′-GCTAA CTCCGTG CCAGCAG CCGCGG-3 ′ 307 bp 51 85
UB-RW 5′-GGGCG TGGACTA CCAGGG TATC-3 ′
UC-FW 5′-CCGC AACGAGC GCAACC CACG-3 ′ 144 bp 55 84
UC-RW 5′-CATT GTAGC ACGTGT GTC-3 ′
HIP-FW 5′-GTACT GCAAAA TTAGT GGCG-3 ′ 148 bp 35 78
HIP-RW 5′-GCAAA GGCAAA GCATC CATA-3 ′

Toate amestecurile PCR (20 μl) conțineau concentrații finale de 200 μM din fiecare deoxinucleotid trifosfat (Sigma-Aldrich, Brøndby, Danemarca), 1 × tampon PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA, SUA), 2,5 mM MgCl 2 (Applied Biosystems), 0,05 U / μl AmpliTaq Gold ADN polimerază (Applied Biosystems), 0,5 μM din fiecare primer (Sigma-Aldrich) și 2 ng de C. jejuni ADN (10 5 exemplare). Termociclarea a constat într-o incubare inițială la 94 ° C timp de 4 minute, urmată de 50 de cicluri de 94 ° C timp de 30 s, 60 ° C timp de 30 sec și 72 ° C timp de 30 secunde și o etapă finală de extindere de 10 min la 72 ° C. PCR multiplex au fost efectuate în același mod folosind 0,5 μM din fiecare primer cu două sau mai multe perechi de primer.

PCR în timp real și analiza curbei de topire

Toate reacțiile în timp real au fost efectuate pe un termociclator cu motor ADN echipat cu un detector în timp real Cromo4 (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, SUA) folosind benzi tubulare de 100 μl albe cu pereți subțiri (Abgene, Surrey, Marea Britanie ). Concentrațiile coloranților (Invitrogen, CA, SUA) utilizate în acest studiu au variat de la 0,1 la 20 μM. Concentrația moleculară a SYBR Green I a fost calculată folosind valoarea de la Zipper et al. [28]. S-a estimat că o soluție 1 × SYBR Green I a fost echivalentă cu 2 μM. Concentrația celorlalți coloranți a fost calculată pe baza concentrației soluției stoc date de furnizor. Măsurătorile fluorescente au fost achiziționate pentru toate cele patru canale spectrale (tabelul S1 din datele suplimentare) la sfârșitul fiecărei etape de extensie de 72 ° C. Curbele de topire au fost achiziționate pentru produsele PCR generate în timpul reacției de amplificare PCR în timp real sau prin PCR convențional fără prezența niciunui colorant. În ultimul caz, coloranții au fost adăugați după PCR și curbele de topire au fost măsurate ulterior în termociclorul PCR în timp real. Semnalele de fluorescență în timpul topirii produselor PCR au fost monitorizate în toate cele patru canale spectrale folosind pași de 0,5 ° C cu o reținere de 10 s la fiecare pas de la 60 ° C la 98 ° C. Analiza diferențiată a curbei de topire a fost realizată utilizând software-ul Opticon Monitor versiunea 2.03.5 (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, SUA) pentru a identifica fiecare vârf și pentru a extrage date brute pentru o analiză ulterioară. Procesarea și analiza detaliată a datelor a fost efectuată folosind versiunea 7 Origin (Origin-Lab, MA, SUA) cu suplimentul de analiză a vârfurilor pentru a extrage înălțimea și zona vârfului. În unele cazuri, probele au fost analizate în continuare prin electroforeză pe gel capilar (CGE) (Agilent 2100 Bioanalyzer, CA, SUA) utilizând setul de cipuri DNA1000 și urmând protocolul dat de furnizor.


Subsol

Informație

Alte

Avantor & reg, o companie Fortune 500, este un furnizor de frunte la nivel mondial de produse și servicii esențiale pentru clienții din biofarmă, asistență medicală, educație și guvernare și tehnologii avansate și industrii de materiale aplicate. Portofoliul nostru este utilizat practic în fiecare etapă a celor mai importante activități de cercetare, dezvoltare și producție din industriile pe care le deservim. Unul dintre cele mai mari puncte forte ale noastre este acela de a avea o infrastructură globală care este amplasată strategic pentru a susține nevoile clienților noștri. Amprenta noastră globală ne permite să deservim peste 225.000 de locații ale clienților și ne oferă acces extins la laboratoare de cercetare și oameni de știință din peste 180 de țări. Am pus știința în mișcare pentru a crea o lume mai bună. Pentru informații, vizitați www.avantorsciences.com și găsiți-ne pe LinkedIn, Twitter și Facebook.

& copia 2021 VWR International, LLC. Toate drepturile rezervate.
© 2021 FORTUNE Media IP Limited Toate drepturile rezervate. Folosit sub licență.

Versiunea dvs. de Internet Explorer nu este acceptată de acest site web. Vă recomandăm să faceți upgrade la Internet Explorer 11 sau la un alt browser acceptat și să verificați dacă utilizați IE11 în Modul Vizualizare Compatibilitate.


Surse de lumină

Lămpile bliț cu xenon emit lumină în intervalul de la 200 nm la 2500 nm. Prin urmare, acestea sunt potrivite pentru a excita orice moleculă care absoarbe lumina din gama UV la gama infraroșu. Acestea prezintă un semnal de ieșire ridicat și sunt de lungă durată. Datorită acestor avantaje, lămpile flash cu xenon sunt utilizate ca sursă de excitație de fluorescență în cititoarele de plăci BMG LABTECH.

Lămpile cu halogen emit lumină începând de la aproximativ 360 nm și nu sunt adecvate pentru a măsura intensitatea fluorescenței UV. În comparație cu lămpile cu xenon, lămpile cu tungsten au o durată de viață mai scurtă, o intensitate de ieșire mai mică și duc la o sensibilitate mai mică, dacă sunt utilizate în detectarea fluorescenței cititorului de microplăci.

Diodele cu emisie de lumină (LED-uri) emit lumină cu intensitate mare, dar numai la o lățime de bandă specifică. În consecință, sunt necesare diode multiple pentru lungimi de undă de excitație diferite, făcând detecția flexibilă a fluoroforilor multipli mai complicată și mai costisitoare.


Cryoprecipitate 101

Crioprecipitatul sau crio pe scurt, este un concentrat derivat din plasma proaspătă congelată (FFP), incluzând fibrinogen, factorii VIII și XIII, factorul von Willebrand și fibronectina. Cryo conține doar 40-50% din factorii de coagulare găsiți într-o unitate de plasmă, dar este concentrat într-un volum redus de 15-20 ml. Crio este preparat din FFP pe măsură ce este dezghețat lent la 4° C. Un precipitat se formează în partea de jos a pungii, care este apoi separat de plasma supernatant. Cryo este depozitat congelat la cel puțin 18 ° C și trebuie transfuzat în decurs de 6 ore de la decongelare sau 4 ore de la punerea în comun. Fiecare unitate de la un donator separat este suspendată în 15 ml de plasmă înainte de a pune în comun.

Cryo este utilizat cel mai frecvent pentru înlocuirea fibrinogenului la pacienții care au sângerare sau cu risc crescut de sângerare. Înlocuirea fibrinogenului poate fi indicată pentru hipofibrinogenemie (fibrinogen & lt 100 mg / dl) sau disfibrinogenemie. Creșterea țintă a nivelului de fibrinogen este de 30-60 mg / dL la adulți și de 60-100 mg / dL la copii și adolescenți. Multe instituții transfuzează crio înainte de administrarea concentratului de factor VIIa pentru a asigura fibrinogen adecvat pentru formarea cheagurilor, având în vedere costul și timpul scurt de înjumătățire al factorului VIIa de aproximativ 4 ore. Înlocuirea fibrinogenului poate fi monitorizată cu un test al nivelului de fibrinogen și răspunsul clinic.

Cryo poate fi utilizat pentru tratarea bolii von Willebrand, a hemofiliei A (deficit de factor VIII) sau a deficitului de factor XIII numai atunci când concentratele adecvate de factor derivat din plasmă sau recombinante nu sunt disponibile și / sau desmopresina (DDAVP) este ineficientă sau contraindicată. Crioul este uneori util dacă disfuncția trombocitară asociată cu insuficiența renală nu răspunde la dializă sau DDAVP. Cryo conține, de asemenea, fibronectină, dar nu există indicații clare pentru înlocuirea fibronectinei.

Aplicarea topică a crio în combinație cu trombina ca „lipici de fibrină” a fost utilizată ca agent hemostatic chirurgical. Această aplicație este întreruptă datorită agenților de etanșare a fibrinei inactivate cu viruși, disponibili comercial, cu concentrații mai mari de fibrinogen.

Din punct de vedere istoric, dozarea a fost un grup de 10 unități pentru adulți și 1-2 unități / 10 kg pentru pacienții pediatrici pe baza conținutului de fibrinogen. Cu toate acestea, banca de sânge și serviciile de transfuzie ar trebui să verifice cu furnizorul lor de sânge conținutul real de fibrinogen în unitățile individuale și pre-combinate, deoarece conținutul de fibrinogen a crescut probabil (

325 mg) datorită pregătirii îmbunătățite. Prin urmare, serviciile de bancă de sânge și transfuzie pot reduce probabil doza standard la 4-5 unități combinate pentru adulți și 1 unitate / 10 kg pentru copii.

O versiune anterioară a acestei postări spunea că crio este înghețat la 1-6°C, acest lucru este incorect. Temperatura corectă este de 18 ° C și a fost corectată în text. Vă mulțumim, cititori pricepuți, pentru corectarea erorilor noastre! & # 8211Editori blocogatori

-Thomas S. Rogers, DO este rezident în al doilea an la Centrul Medical al Universității din Vermont, instructor clinic la Colegiul de Medicină al Universității din Vermont și director medical asistent al Băncii de Sânge și Serviciului de Medicină Transfuzie.


Detectarea și cuantificarea ADN-ului virusului hepatitei B prin reacția în lanț de polimerază verde în timp real SYBR

A fost evaluată și comparată o analiză a reacției în lanț a polimerazei în timp real (PCR), în timp real, bazată pe tehnologia colorantului verde SYBR pentru detectarea și cuantificarea ADN-ului virusului hepatitei B (VHB) în ser și comparată cu un PCR imbricat calitativ și monitorul HBV Cobas Amplicor test (Roche Molecular Diagnostics, Milano, Italia). Performanța testului PCR în timp real a fost evaluată într-un cadru de laborator clinic de rutină cu un total de 212 de probe clinice. Sensibilitatea PCR în timp real a corespuns cu 31 UI / ml (70 copii / ml), iar comparația cu PCR imbricată calitativ a arătat concordanță semnificativă pentru 94% din probe. Curba liniară pe 7 unități log, cuprinzând 10 3 –10 9 UI / ml (2,28 × 10 3 până la 2,28 × 10 9 copii / ml), a fost observată la determinarea cantitativă. Coeficientul de variabilitate interexperimentală al testului a variat de la 0,22 la 0,39 și coeficientul de variabilitate intraexperimental de la 0,24 la 0,41. Prin excluderea valorilor în afara intervalelor dinamice ale ambelor teste, monitorul HBV și PCR în timp real au dat un acord în ± 1 unitate log pentru 90% din probe, în timp ce cele pentru restul de 10% s-au dovedit a fi peste 1 unitate log dar mai puțin de 1,5 unități de jurnal. Când au fost examinate rezultatele în interiorul și în afara intervalului dinamic al monitorului HBV, 90% din rezultate au fost de acord. În concluzie, PCR-ul în timp real bazat pe tehnologia verde SYBR s-a dovedit potrivit pentru scopuri de diagnostic de rutină, prezentând o sensibilitate bună, specificitate ridicată, reproductibilitate ridicată și liniaritate bună într-un interval dinamic larg de cuantificare.

Aceasta este o previzualizare a conținutului abonamentului, acces prin intermediul instituției dvs.


REACTIVI ȘI SOLUȚII

Tampoane pentru purificarea Taq polimerazei

Compoziţie La 100 ml
50 mM Tris⋅HCl, pH 8 (Moore, 1996) 5 ml de 1 M
500 mM NaCI 10 ml de 5 M
0,1% NP-40 1 ml de 10% (v/v)
0,1% Triton X-100 1 ml de 10% (v / v)
Apă La 100 ml
A se păstra până la 1 săptămână sau mai mult la 4 ° C
Compoziţie La 100 ml
50 mM Tris⋅HCl, pH 8 (Moore, 1996) 5 ml de 1 M
500 mM NaCI 10 ml de 5 M
0,05% NP-40 0,5 ml de 10% (v / v)
5% glicerol 10 ml de 50% (v / v)
10 mM imidazol 0,5 ml de 2 M
5 mM β-mercaptoetanol (adăugați imediat înainte de utilizare) 36 μl
1 mM benzamidină (adăugați imediat înainte de utilizare) 100 μl de 1 M.
Apă La 100 ml
A se păstra până la 1 săptămână sau mai mult la 4°C. Cu toate acestea, agenți reducători (DTT sau BME) și inhibitor de protează (benzamidină) trebuie adăugați imediat înainte de utilizare.
1 mM DTT poate fi substituit cu 5 mM β-mercaptoetanol în Taq tampoane de purificare.
Compoziţie La 100 ml
50 mM Tris⋅HCl, pH 8 (Moore, 1996) 5 ml de 1 M
100 mM NaCI 2 ml de 5 M
0,05% NP-40 0,5 ml de 10% (v / v)
5% glicerol 10 ml de 50% (v / v)
10 mM imidazol 0,5 ml de 2 M
5 mM β-mercaptoetanol (adăugați imediat înainte de utilizare) 36 μl
1 mM benzamidină (adăugați imediat înainte de utilizare) 100 μl de 1 M.
Apă La 100 ml
A se păstra până la 1 săptămână sau mai mult la 4°C. Cu toate acestea, agenți reducători (DTT sau BME) și inhibitor de protează (benzamidină) trebuie adăugați imediat înainte de utilizare.
Compoziţie Pe 10 ml
50 mM Tris⋅HCl, pH 8 (Moore, 1996) 0,5 ml de 1 M
100 mM NaCI 0,2 ml de 5 M
0,05% NP-40 0,05 ml de 10% (v / v)
5% glicerol 1 ml de 50% (v / v)
300 mM imidazol 1,5 ml de 2 M
5 mM β-mercaptoetanol (adăugați imediat înainte de utilizare) 3,6 μl
1 mM benzamidină (adăugați imediat înainte de utilizare) 10 μl de 1 M.
Apă 6,7 ml
A se păstra până la 1 săptămână sau mai mult la 4 ° C. Cu toate acestea, agenți reducători (DTT sau BME) și inhibitor de protează (benzamidină) trebuie adăugați imediat înainte de utilizare.

Tampon de dializă cu heparină

Compoziţie Pe 1 L
50 mM Tris⋅HCl, pH 8 (Moore, 1996) 50 ml de 1 M
100 mM NaCI 20 ml de 5 M
0,05% NP-40 5 ml de 10% (v/v)
10% glicerol 100 ml
5 mM p-mercaptoetanol 360 μl
1 mM benzamidină 1 ml de 1 M
Apă La 1 l
A se păstra până la 1 săptămână sau mai mult la 4 ° C. Cu toate acestea, agenți reducători (DTT sau BME) și inhibitor de protează (benzamidină) trebuie adăugați imediat înainte de utilizare.
Compoziţie La 1 l
50 mM Tris⋅Cl, pH 8 (Moore, 1996) 50 ml de 1 M
0,05% NP-40 5 ml de 10% (v/v)
10% glicerol 100 ml
5 mM p-mercaptoetanol 360 μl
Apă Până la 1 L
Se împarte în 2 × 500 ml, care vor fi tamponul A și tamponul B
Se adaugă 2,92 g NaCI la 500 ml pentru tamponul A (concentrația finală de NaCI 100 mM)
Se adaugă 29,2 g NaCI la 500 ml pentru tamponul B (concentrația finală de NaCI 1 M)
A se păstra până la 1 săptămână sau mai mult la 4 ° C. Cu toate acestea, agenți reducători (DTT sau BME) și inhibitor de protează (benzamidină) trebuie adăugați imediat înainte de utilizare.

tampon de reticulare Taq

Compoziţie La 2 L
50 mM HEPES, pH 8 100 ml de 1 M
50 mM KCl 7,45 g solid
0,1% NP-40 20 ml de 10% (v / v)
0,1% Tween 20 20 ml de 10% (v/v)
Apă Până la 2 L
A se păstra până la 1 săptămână sau mai mult la 4 ° C

Taq tampon de dializă post-reticulare

Compoziţie Pe 2 L
20 mM Tris · HCI, pH 7,5 (Moore, 1996) 40 ml de 1 M
200 mM KCI 29,8 g
1 mM EDTA 4 ml
Apă Până la 2 L
A se păstra până la 1 săptămână sau mai mult la 4 ° C
Compoziţie Pe 1 L
50 mM Tris⋅HCl pH 8 50 ml 1 M
100 mM NaCI 25 ml 5 M
0,1 mM EDTA 0,2 ml 0,5 M
50% glicerol 500 ml
TDM 3 mM Adăugați 231 mg de DTT la 500 ml imediat înainte de utilizare
Apă Până la 1 L
A se păstra până la 1 săptămână sau mai mult la 4 ° C. Cu toate acestea, agenți reducători (DTT sau BME) și inhibitor de protează (benzamidină) trebuie adăugați imediat înainte de utilizare.

Tampoane pentru purificarea revers transcriptazei M-MLV

Compoziţie La 100 ml
50 mM Tris · HCI, pH 8 (Moore, 1996) 5 ml de 1 M
100 mM NaCI 2 ml de 5 M
10 mM imidazol 0,5 ml de 2 M (pH 8)
1 mM DTT 200 μl de 0,5 M
0,1% Triton X-100 1 ml de 10% (v / v)
Apă La 100 ml
A se păstra până la 1 săptămână sau mai mult la 4 ° C. Cu toate acestea, agenții reducători (DTT sau BME) și inhibitorul de protează (benzamidină) trebuie adăugați imediat înainte de utilizare.
Compoziţie La 100 ml
50 mM Tris · HCI, pH 8 (Moore, 1996) 5 ml de 1 M
500 mM NaCI 10 ml de 5 M
10 mM imidazol 500 µl de 2 M (pH 8)
1 mM TDT 200 pl de 0,5 M
0,1% Triton X-100 1 ml de 10% (v / v)
Apă La 100 ml
A se păstra până la 1 săptămână sau mai mult la 4 ° C. Cu toate acestea, agenți reducători (DTT sau BME) și inhibitor de protează (benzamidină) trebuie adăugați imediat înainte de utilizare.

Tampon de eluție RT M-MLV

Compoziţie La 100 ml
50 mM Tris · HCI, pH 8 (Moore, 1996) 5 ml de 1 M
100 mM NaCI 2 ml de 5 M
250 mM imidazol 12,5 ml de 2 M (pH 8)
1 mM TDT 200 pl de 0,5 M
0,1% Triton X-100 1 ml de 10% (v/v)
Apă La 100 ml
A se păstra până la 1 săptămână sau mai mult la 4 ° C. Cu toate acestea, agenți reducători (DTT sau BME) și inhibitor de protează (benzamidină) trebuie adăugați imediat înainte de utilizare.
Compoziţie 1 L 2 L
50 mM Tris · HCI, pH 8 (Moore, 1996) 50 ml de 1 M 100 ml de 1 M
100 mM NaCI 20 ml de 5 M 40 ml de 5 M
0,1 mM EDTA 200 μl de 0,5 M 400 pl de 0,5 M
5 mM TDT 770 mg pulbere 1540 mg
0,1% Triton X-100 10 ml de 10% (v / v) 20 ml de 10% (v / v)
Apă Până la 1 L Până la 2 L
A se păstra până la 1 săptămână sau mai mult la 4 ° C. Cu toate acestea, agenți reducători (DTT sau BME) și inhibitor de protează (benzamidină) trebuie adăugați imediat înainte de utilizare.

Se adaugă 500 ml tampon SP A (vezi rețeta) cu 26,3 g NaCl pentru a da o concentrație finală de NaCl 1 M.

Buffer de stocare M-MLV RT

Compoziţie 1 L
50 mM Tris · HCI, pH 8 (Moore, 1996) 50 ml de 1 M
100 mM NaCI 20 ml de 5 M
0,1 mM EDTA 200 μl de 0,5 M
TDM 5 mM Adăugați 385 mg de DTT la 500 ml imediat înainte de utilizare
0,1% Triton X-100 10 ml de 10% (v / v)
50% glicerol 500 ml
Apă Până la 1 L
A se păstra până la 1 săptămână sau mai mult la 4 ° C. Cu toate acestea, agenții reducători (DTT sau BME) și inhibitorul de protează (benzamidină) trebuie adăugați imediat înainte de utilizare.

Agar LB

Combinați ingredientele enumerate pentru mediul lichid LB (vezi rețeta) plus 7,5 g de agar (de exemplu, Thermo Fisher, AAJ10654P2) per L. Sterilizați prin autoclavare pe un ciclu de lichid (20 min la 15 psi). Lăsați soluția să se răcească la aproximativ 55 ° C, adăugați antibiotic la concentrația finală dorită și turnați un strat subțire de soluție în cutii Petri din plastic (aproximativ 20 ml în fiecare), având grijă să evitați introducerea bulelor. Lăsați plăcile să se solidifice la temperatura camerei înainte de a le transfera la 4 ° C pentru depozitare de până la ± 1-2 luni.

LB mediu lichid

Compoziţie 1 L
1% (g/v) Bacto triptonă (de exemplu, Thermo Fisher, 211705) 10 g
1% (g / v) clorură de sodiu 10 g
0,5% (greutate / volum) extract de drojdie 5 g
Apă Până la 1 L
Se amestecă până când ingredientele sunt dizolvate și se autoclavează pe un ciclu de lichid (20 min la 15 psi) pentru a steriliza
A se păstra până la 1 an sau mai mult la temperatura camerei

Soluție salină tamponată cu fosfat (PBS)

Compoziţie 1 L
137 mM NaCI 8 g NaCI solid
2,7 mM KCI 0,2 g KCl solid
10 mM Na2HPO4 1,44 g Na solid2HPO4
1,8 mM KH2PO4 0,24 g KH solid2PO4
Reglați pH-ul la 7,4 cu HCI și adăugați apă distilată la un volum total de 1 L.
A se păstra până la 1 an sau mai mult la temperatura camerei

Tampon de probă SDS

Compoziţie 10 ml
200 mM Tris · HCI, pH 6,8 (Moore, 1996) 2 ml de 1 M stoc
8% dodecilsulfat de sodiu 0,8 g
40% glicerol 4 ml
4% (g / v) β-mercaptoetanol 0,4 ml
50 mM EDTA 1,0 ml de stoc 0,5 M, pH 7,5
0,08% (greutate / volum) albastru de bromofenol 8 mg
A se păstra până la 1 an sau mai mult la -20 ° C

Soluție de acetat de sodiu, 3 M, pH 5,2

Se adaugă 24,6 g de pulbere de acetat de sodiu la 100 ml volumul final dorit de soluție, se ajustează pH-ul la 5,2 cu acid acetic glacial și se aduce la volumul final dorit cu apă.


Conexiuni Promega

Reacția în lanț a polimerazei (PCR) a revoluționat biologia modernă ca o modalitate rapidă și ușoară de a genera cantități uimitoare de date genomice. Cu toate acestea, atunci când PCR nu funcționează, poate fi frustrant. În aceste momente, inhibitorii PCR și transcripția inversă a PCR (RT-PCR) par a fi peste tot: Ele stau latente în materialul dvs. de pornire și pot co-purifica cu șablonul de interes și pot fi introduse în timpul manipulării probelor sau al configurării reacției. Efectele acestor inhibitori pot varia de la inhibarea parțială și subestimarea cantității țintă de acid nucleic până la eșecul complet de amplificare. Ce trebuie să facă un om de știință?

Primul pas este educația, trebuie să înveți cu ce te confrunți. Aici, mă voi concentra asupra semnelor că inhibitorii cauzează probleme cu PCR cantitativă.

Înainte de a putea depăși efectele adverse ale inhibitorilor PCR, trebuie să vă dați seama că există o problemă. Sună ușor, nu? Fie PCR-ul a funcționat, fie nu a funcționat. Din păcate, nu este atât de simplu. Inhibarea PCR și RT-PCR nu este adesea un fenomen totul sau nimic și poate avea o serie de cauze diferite, inclusiv inhibarea ADN polimerazei sau a transcriptazei inverse, chelarea factorilor necesari și interferența cu legarea primerului, precum și cauzele care imită adevărata inhibiție, cum ar fi adsorbția șablonului în tub, degradarea șablonului sau primerului și interferența cu semnalul fluorescent.

Pentru qPCR, de multe ori puteți afla ceva despre tipul de inhibiție din schimbările din ciclul de cuantificare (Cq, cunoscut anterior ca CT) valoare, punctul în care curba de amplificare trece un prag de detecție în care semnalul datorat acumulării produsului poate fi distins în mod fiabil de fundal. Cq valoarea este invers proporțională cu cantitatea de șablon: cu cât este mai mult șablon, cu atât ținta este detectată mai devreme.

De asemenea, puteți învăța ceva din panta unui grafic creat prin trasarea concentrației de acid nucleic log față de Cq valoare pentru o serie de diluții de acid nucleic. Pentru un qPCR cu eficiență de 100%, panta unui astfel de grafic va fi –3,32. O pantă de la –3,3 la –3,6 indică o eficiență bună de amplificare (100% până la 90%, respectiv), iar o pantă sub –3,6 indică o eficiență slabă și o posibilă inhibiție.

Iată doar câteva exemple despre modul în care poate fi detectată inhibarea qPCR prin examinarea datelor și a curbelor de amplificare.


Inhibarea Taq ADN polimeraza se caracterizează printr-o creștere a Cq valoare și o modificare a morfologiei curbei de amplificare, așa cum se arată în exemplul din dreapta. Cu toate acestea, a crescut Cq valorile pot indica, de asemenea, cantități mai mici de țintă. Această posibilitate se poate distinge de un C crescutq valoarea datorată inhibării Taq ADN polimeraza prin utilizarea unui control intern PCR (IPC). IPC este un set de primer și șablon care este inclus în amestecul de reacție împreună cu primerii specifici pentru țintele de testare primare. Amplificarea IPC ar trebui să aibă loc cu o eficiență egală (C similarq valori) în toate probele dacă IPC Cq valoarea eșantionului de testare este întârziată în mod substanțial față de cea a unui control standard sau pozitiv, atunci aceasta indică un inhibitor în eșantionul de testare. O altă modalitate de a face această distincție este să diluați în serie șablonul și să căutați schimbări mai mici decât cele așteptate în Cq valori: la o eficiență de 100%, cantitatea de produs se dublează după fiecare ciclu. Astfel, pentru diluții de zece ori, Cq valorile trebuie să fie la aproximativ 3,3 cicluri distanță (2 3,3 = 10) a C.q schimbarea mai mică de 3,3 cicluri ar sugera puternic inhibarea.

În RT-qPCR, inhibarea transcriptazei inverse este caracterizată printr-o schimbare a C.q valorile. Curba de amplificare va arăta perfect normală (așa cum se arată în dreapta). Acest tip de inhibiție va avea ca rezultat subestimarea cantității de ARN țintă în materia primă și va determina Cq valoare care trebuie deplasată spre dreapta. Din nou, diluțiile IPC și seriale ale șablonului pot fi utilizate pentru a determina dacă această schimbare se datorează inhibării sau pur și simplu unei cantități mai mici de țintă.


Materiale și metode

Caracterizarea CpG-urilor analizate

Cele trei CpG analizate cu niveluri diferite de metilare au fost selectate pe baza datelor donatorilor sănătoși din Infinium MethylationEPIC BeadChip (Illumina, San Diego, CA, SUA) dobândite în lucrarea noastră anterioară [40]. Caracteristica locurilor alese este rezumată în Tabelul 7. Aceste dinucleotide CpG au fost de asemenea alese astfel încât să se afle în secvența CCGG pentru a permite tăierea lor prin MSRE.

Probe și standarde ADN

Acest studiu a fost aprobat de Comitetul de etică instituțional și toți donatorii de sânge și-au dat acordul deplin. Celulele mononucleare ale a zece donatori de sânge sănătoși au fost recoltate din straturi tamponate prin centrifugare cu gradient Ficoll (Histopaque, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SUA). ADN-ul a fost extras folosind sistemul MagCore (RBCBioscience, New Taipei City, Tchaj-wan). Setul de ADN metilat și nemetilat uman (Zymo Research, Irvine, CA, SUA) a fost utilizat ca standarde metilate și nemetilate.

Analiza MSRE

Un pas qMethyl Kit (Zymo Research) a fost utilizat pentru analiza MSRE. Pentru fiecare probă, ADN-ul (20 ng) a fost prelucrat prin reacțiile de testare și referință conform protocolului producătorului. În etapa PCR, TAnn a fost setat la 60 °C și timpul de recoacere a fost scurtat la 45 s. Pentru efectuarea măsurătorilor a fost utilizată platforma Rotor-Gene Q 2plex HRM (Qiagen, Hilden, Germania).

Conversia bisulfitului

ADN-ul (500 ng) a fost tratat cu bisulfit folosind EZ DNA Methylation-Lightning Kit (Zymo Research). Pentru experimentele MS-HRM și qMSP, concentrația de ADN convertit BS a fost măsurată prin spectrofotometru NanoDrop ™ One / OneC Microvolume UV-Vis (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SUA) și apoi ajustată la 10 ng · μl - 1.

Primer Design

Pentru analiza MSRE, a fost utilizat software-ul online Primer3Plus (http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi). Pentru metodele care necesită ADN convertit BS, am folosit Methyl Primer Express Software v1.0 (Thermo Fisher Scientific). Pentru secvențele și caracteristicile primerilor vezi Tabelul 1. Pozițiile tuturor perechilor de primeri din regiunile studiate sunt prezentate în Fig. 3.

Pozițiile perechilor de primeri, CpG și situsurile de restricție în regiunile studiate. CpG-urile sunt prezentate ca bare roșii și galbene pe o linie care reprezintă secvența ADN. CpG roșu este cel ales inițial din Infinium MethylationEPIC BeadChip. Foarfeca indică siturile tăiate de MSRE. Primerii albastru mai deschis au fost utilizați pentru PCR inițială de pirozecvenție și primerii albastru mai închis reprezintă primerii de secvențiere. Primerii HRM cu model verde deschis au fost proiectați cu un CpG la capătul său 5 (primeri M/U Wojdacz)

Pirosequencing

ADN convertit BS (10-20 ng) a fost mai întâi amplificat folosind HotStar HiFidelity Polymerase Kit (Qiagen) cu MgCl final 2,5 mM2 concentraţie. Pentru a crește specificitatea primerilor și pentru o încărcare ușoară a gelului, am adăugat CoralLoad Concentrate din kitul PyroMark PCR (Qiagen) la concentrația finală de 1x. Concentrația finală a primerului biotinilat înainte și universal a fost de 0,2 μM. Concentrația finală a primerului cu coadă inversă a fost de 0,04 μM. Am folosit condițiile de reacție PCR recomandate pentru PyroMark PCR cu 48 cicluri PCR și TAnn conform Tabelului 1. Calitatea ampliconului (1 μl de reacție PCR) a fost verificată utilizând electroforeză pe gel de agaroză 2%. Pirosecvențierea a fost efectuată pe instrumentul PyroMark Q24 (Qiagen). Protocolul de pirosecvențiere (Manual de utilizare 01/2016) a fost optimizat prin adăugarea a 2 μl de margele de Streptavidină acoperite cu sepharose (pasul 5.3.3.2) și prin prelungirea etapei de agitare la 20 de minute (pasul 5.3.3.6).

Analiza MS-HRM

Am pregătit 100, 75, 50, 25, 10 și 0% standarde metilate prin amestecarea standardelor ADN convertite BS metilate și nemetilate. 15 ng de probe și standarde convertite BS au fost procesate folosind EpiTect HRM PCR Kit (Qiagen). Condițiile de reacție au fost stabilite conform protocolului producătorului. Cantitatea de reactivi a fost ajustată la 20 μl volum final. Concentrația finală a primerilor a fost de 0,375 μM. Experimentul a fost efectuat pe platforma Rotor-Gene Q 2plex HRM (Qiagen). Pentru analiza HRM, rampa a fost setată de la 67,1 la 82,2 ° C, crescând cu 0,1 ° C / 2 s. Datele brute au fost procesate utilizând instrumentul web uAnalyze [41]. În software, am efectuat normalizarea de bază și am calculat curbele de diferență pentru toate standardele și eșantioanele folosind standardul metilat 0% ca o curbă de referință. Curbele de calibrare au fost apoi trasate în Microsoft Excel conform Tse și colab. [27] folosind înălțimile vârfurilor și AUC ale datelor procesate ale standardelor. Din curbele de calibrare s-a calculat procentul de metilare a probelor analizate.

PCR cantitativ cu analiza ulterioară a curbei de topire a fost efectuată cu 10-15 ng de ADN convertit cu BS. Amestecul de reacție (20 pl) a fost preparat folosind kitul QuantiTect SYBR® Green PCR (Qiagen). Concentrația finală a primerilor a fost de 0,5 μM. Am păstrat condițiile de ciclism recomandate cu 40 de cicluri și TAnn conform Tabelului 1. Într-o singură cursă, toate probele împreună cu standardele ADN metilat și nemetilat au fost amplificate cu primeri MSP metilat, MSP nemetilat și HRM. Pentru fiecare set de grunduri, eficiența de amplificare a fost calculată în conformitate cu Dorak și colab. [42]. Am efectuat qPCR cu patru diluții de ADN convertit BS dintr-o probă și am trasat logaritmul decadic al diluțiilor împotriva C dobânditts. Eficiența a fost apoi calculată din panta curbei de calibrare după cum urmează: (E = left [<10> ^ < left (- frac <1> ight)>-1 ight]ullet 100 ) . Toate măsurătorile au fost efectuate utilizând sistemul de PCR în timp real StepOnePlus (Thermo Fisher Scientific). Nivelurile de metilare au fost calculate utilizând toate cele trei abordări revizuite în Husseiny și colab. [36].


Priveste filmarea: Cum iti alegi placa de par (Ianuarie 2022).