Informație

8.3: Pregătirea probei - Biologie


Pregătiți-vă probele pentru electroforeză în timp ce gelul se întărește prin adăugarea unui tampon de încărcare concentrat. Tamponul de încărcare conține, de asemenea, glicerol, ceea ce face proba suficient de densă pentru a se scufunda până la fundul probei.

Adăugați 4 μL de tampon de încărcare 6X direct la fiecare dintre reacțiile PCR de 20 μL din ultimul laborator. Pe scurt, centrifugați fiecare tub pentru a amesteca vopseaua și probele, dacă este necesar. Veți folosi jumătate din fiecare probă în gelurile dumneavoastră. Păstrați proba rămasă la frigider.


8.3: Pregătirea probei - Biologie

Principiul PAGINII native:

PAGE nativ folosește aceleași fronturi discontinue de ioni de clorură și glicină ca SDS-PAGE pentru a forma limite mobile care stivuiesc și apoi separă polipeptidele prin raportul sarcină/masă. Proteinele sunt preparate într-un tampon non-reducător, care nu menține denaturarea, care menține structura secundară a proteinelor și densitatea de încărcare nativă. Prin urmare, puteți vedea cu ușurință mai multe benzi din camera cu gel PAGE nativă dacă proteina dvs. țintă are forme polimerizate în eșantion. În electroforeza PAGE nativă majoritatea proteinelor au un pl acid sau ușor bazic (punct izoelectric) (

3–8) și migrează spre polarul negativ. De exemplu, dacă proteina dumneavoastră este mai mare de 8,9, ar trebui să inversați anodul și să rulați gelul PAGE nativ.

Aflați mai multe despre Native-PAGE:

  • Pentru sistemul de electroforeză, se recomandă un sistem bio-rad.
  • Pentru un gel de stivuire PAGE nativ de 5 ml

*: Adăugat chiar înainte de fiecare utilizare.

Pentru un gel de separare PAGE nativ de 10 ml:

Procentul de acilamidă 6% 8% 10% 12% 15%
Acrilamidă / Bis-acrilamidă (30% / 0,8% g / v) 2 ml 2,6 ml 3,4 ml 4 ml 5 ml
0,375 M Tris-HCI (pH = 8,8) 7,89 ml 7,29 ml 6,49 ml 5,89 ml 4,89 ml
* 10% (g / v) persulfat de amoniu (AP) 100μl 100μl 100μl 100μl 100μl
* TEMED 10μl 10μl 10μl 10μl 10μl

*: Adăugat chiar înainte de fiecare utilizare.

Tampon de probă (2x):

62,5 mM Tris-HCI, pH 6,8
25% glicerol Glicerol
1% albastru de bromofenol

25 mM Tris
Glicină 192 mM

Notă: bufferul de rulare ar trebui să fie

pH 8,3. Nu reglați pH-ul.

Protocol de rulare cu gel:

1. Pregătiți o cantitate adecvată de gel de separare într-un pahar mic, apoi adăugați volumul specific. de AP și TEMED și răsuciți ușor beackerul pentru a asigura o amestecare suficientă. Pipetați soluția de gel în spațiul dintre plăcile de sticlă de turnare cu gel (Nu umpleți complet). Umpleți spațiul de odihnă cu apă (izopropanol alternativ). Se lasă 20-30 de minute pentru o gelificare completă.

2. Puteți pregăti soluția de gel de stivuire în timp ce gelul de separare se gelifică. Pregătiți cantitatea adecvată de gel de stivuire într-un beacker și amestecați cu 10% AP și 1% TEMED. Turnați apa în primul pas și pipetați soluția de gel de stivuire în spațiu și introduceți pieptene. Se lasă 20-30min să se lase să se gelifice.

3. Amestecați proba cu tamponul de probă. Nu încălziți proba!

4. Încărcați amestecul de probă și setați o tensiune adecvată pentru a rula electroforeza.

Notă: Este mai bine să puneți sistemul pe gheață și să nu setați un Volt relativ ridicat în cazul în care proteinele se degradează.

5. Colorați așa cum ați face un protocol standard Coomassie-blue sau treceți la o procedură de imuno-blotare (western-blot).


8.3: Pregătirea probei - Biologie

PAGE-SDS Protocol Laemmli


% acrilamidă 10% 10% 12% 12% 15%
Număr de minigeli 5 8 5 8 5
1,5M TrisHCl pH 8,3 + 0,4% SDS 7,0 ml 10,5 ml 7,0 ml 10,5 ml 7,0 ml
30% Acrilamidă 0,8% metilen bis acrilamidă 9,3 ml 13,9 ml 11,3 ml 16,9 ml 13,9 ml
H 2 O 12,3 ml 18,4 ml 9,3 ml 13,9 ml 6,3 ml
10% APS 100 ul 150 ul 100 ul 150 ul 100 ul
TEMED 23 ul 35 ul 23 ul 35 ul 23 ul

% Acrilamidă 10% 10% 12% 12% 15%
Numărul de Minigeluri 5 8 5 8 5
1,5 M TrisHCl pH 8,3 + 0,4% SDS 7,0 ml 10,5 ml 7,0 ml 10,5 ml 7,0 ml
40% Acrilamidă / metilen bis acrilamidă (raport: 37,5:1) 7,2 ml 10,8 ml 8,6 ml 12,9 ml 10,8 ml
H 2 O 14,4 ml 21,5 ml 12 ml 17,9 ml 9,4 ml
10% APS 100 ul 150 ul 100 ul 150 ul 100 ul
TEMED 23 ul 35 ul 23 ul 35 ul 23 ul

Adăugați TEMED și APS la final. Rotiți ușor balonul pentru a amesteca, având grijă să nu generați bule. Pipetați soluția la un nivel de 4 cm din partea superioară. Adăugați 0,3 ml de n-butanol. O interfață lichidă foarte ascuțită va fi vizibilă în decurs de 10-20min. Lăsați gelul să polimerizeze încă o oră cel puțin. Clătiți suprafața gelului cu apă înainte de a turna gelul de stivuire.

Gel de stivuire

Numărul de Minigeluri 2 5 8
Număr de minigeli 2 5 8
TrisHCl 0,5M pH 6,8+ 0,4% SDS 2,5 ml 4,0 ml 5,2 ml 0,5M TrisHCl pH 6,8+ 0,4% SDS 2,5 ml 4,0 ml 5,2 ml
30 % acrilamidă 0,8% metilen bis acrilamidă 1,0 ml 1,5 ml 2,0 ml 40 % Acrilamidă / metilen bis acrilamidă (raport: 37,5: 1) 0,75 ml 1,1 ml 1,4 ml
H 2 O 6,4 ml 9,6 ml 12,8 ml H 2 O 6,6 ml 10 ml 13,4 ml
10% APS 100 ul 150 ul 200 ul 10% APS 100 ul 150 ul 200 ul
TEMED 10 ul 15 ul 20 ul TEMED 10 ul 15 ul 20 ul

Umpleți fiecare sandviș cu soluție de gel stivuitor și introduceți un pieptene în fiecare loc, având grijă să nu prindeți bule sub dinți. Gelul trebuie să se polimerizeze complet după 1 oră. Acoperiți gelul cu o folie de nailon. Păstrați gelurile nu mai mult de 2 săptămâni la 4 ° C.

Înainte de adăugarea tamponului de probă, păstrați probele la 0°C. Se adaugă tamponul de probă SDS (RT) la probă (încă pe gheață) și se fierbe la 100°C imediat 3 până la 5 minute. NU lăsați proba în tamponul de probă SDS fără încălzirea proteazei endogene sunt foarte active în tamponul de probă SDS și pot provoca degradări severe. Odată încălzit, proba ar putea sta la temperatura camerei pentru o perioadă scurtă de timp până la încărcare sau la -20 ° C pentru o perioadă lungă de timp.
Pentru o grosime de gel de 0,75 mm și 15 godeuri, s-au aplicat 10-25ug proteină dintr-un amestec complex, la colorarea cu Coomasie Blue și 0,5 până la 5ug pentru probe pentru una sau câteva proteine. Dacă se folosește colorant de argint, se pot folosi de 10 până la 100 de ori mai puține proteine.
Probele pot fi concentrate sau interferențele (săruri etc.) eliminate cu TCA, acetonă, TCA-DOC, etanol etc. (vezi Protocolul atașat). Ionii de potasiu în special trebuie îndepărtați, deoarece precipită SDS.
Unele proteine, cum ar fi proteinele nucleare non-histonice și proteinele de membrană, necesită prezența ureei 8M în tamponul probei SDS pentru a obține o solubilizare completă.
Unele proteine ​​legate de membrană suferă agregare la temperaturi peste 40-50 ° C. În acest caz, incubați 30min la 40 °C cu tampon de probă.
O schimbare a distantelor de migrare a proteinelor
cu punți disulfură interne poate fi observat prin incubarea probelor în SDS în prezența sau absența agenților reducători (mercaptoetanol, DTT, DTE etc.)


Cuprins

Pregătirea bibliotecii Editați

Pașii generali pentru a pregăti o bibliotecă ADN complementară (ADNc) pentru secvențiere sunt descriși mai jos, dar adesea variază între platforme. [8] [3] [9]

  1. Izolarea ARN-ului:ARN-ul este izolat din țesut și amestecat cu dezoxiribonuclează (DNază). DNaza reduce cantitatea de ADN genomic. Cantitatea de degradare a ARN este verificată cu gel și electroforeză capilară și este utilizată pentru a atribui un număr de integritate ARN probei. Această calitate ARN și cantitatea totală de ARN inițial sunt luate în considerare în timpul etapelor ulterioare de pregătire, secvențiere și analiză a bibliotecii.
  1. Selecție / epuizare ARN: Pentru a analiza semnale de interes, ARN-ul izolat poate fi păstrat ca atare, filtrat pentru ARN cu cozi 3 'poliadenilate (poli (A)) pentru a include doar ARNm, epuizat de ARN ribozomal (ARNr) și / sau filtrat pentru ARN care leagă secvențe specifice (Metode de selectare și epuizare a ARN-ului tabel, mai jos). ARN-ul cu cozi 3 'poli (A) este compus în principal din secvențe de maturare, procesate, codificatoare. Selecția poli (A) se realizează prin amestecarea ARN-ului cu oligomeri poli (T) atașați covalent la un substrat, în mod tipic margele magnetice. [10][11] Selecția poli(A) are limitări importante în detectarea biotipului ARN. Multe biotipuri de ARN nu sunt poliadenilate, incluzând multe transcripții de ARN și histone-nuclee necodificate sau sunt reglate prin lungimea cozii poli (A) (de exemplu, citokine) și, prin urmare, s-ar putea să nu fie detectate după selecția poli (A). [12] În plus, selecția poli(A) poate crește părtinirea 3’, în special cu ARN de calitate inferioară. [13] [14] Aceste limitări pot fi evitate cu epuizarea ribozomală, eliminând ARNr care reprezintă de obicei peste 90% din ARN într-o celulă. Atât etapele de îmbogățire poli (A), cât și etapele de epuizare ribozomală necesită multă muncă și ar putea introduce prejudecăți, astfel încât au fost dezvoltate abordări mai simple pentru a omite aceste etape. [15] Țintele mici de ARN, cum ar fi miARN, pot fi izolate în continuare prin selectarea mărimii cu geluri de excludere, margele magnetice sau truse comerciale.
  1. Sinteza ADNc: ARN-ul este transcris invers în ADNc, deoarece ADN-ul este mai stabil și permite amplificarea (care utilizează ADN polimeraze) și pârghia tehnologiei de secvențiere a ADN-ului mai matur. Amplificarea ulterioară transcrierii inverse are ca rezultat pierderea eșantionării, care poate fi evitată prin etichetarea chimică sau secvențierea unei singure molecule. Fragmentarea și selecția dimensiunii sunt efectuate pentru a purifica secvențele care au lungimea adecvată pentru mașina de secvențiere. ARN, ADNc sau ambele sunt fragmentate cu enzime, sonicare sau nebulizatoare. Fragmentarea ARN reduce distorsiunea de 5 'a transcrierii inversate amorsate aleatoriu și influența siturilor de legare a primerului, [11] cu dezavantajul că capetele 5' și 3 'sunt convertite în ADN mai puțin eficient. Fragmentarea este urmată de selectarea dimensiunii, unde fie secvențele mici sunt eliminate, fie sunt selectate o gamă restrânsă de lungimi de secvență. Deoarece ARN-urile mici, cum ar fi miARN-urile, se pierd, acestea sunt analizate independent. ADNc-ul pentru fiecare experiment poate fi indexat cu un cod de bare hexamer sau octamer, astfel încât aceste experimente să poată fi reunite într-o singură bandă pentru secvențierea multiplexată.

Secvențierea ADN complementară (ADNc-Seq) Edit

Biblioteca cADN derivată din biotipurile de ARN este apoi secvențiată într-un format lizibil de computer. Există multe tehnologii de secvențiere cu randament ridicat pentru secvențierea ADNc, inclusiv platforme dezvoltate de Illumina, Thermo Fisher, BGI / MGI, PacBio și Oxford Nanopore Technologies. [16] Pentru secvențierea cu citire scurtă Illumina, o tehnologie comună pentru secvențierea ADNc, adaptoarele sunt ligate la ADNc, ADN-ul este atașat la o celulă de flux, clusterele sunt generate prin cicluri de amplificare și denaturare a punții, iar secvența prin sinteză este efectuate în cicluri de sinteză complementară a catenelor și excitație laser a bazelor cu terminatori reversibili. Alegerea platformei de secvențiere și parametrii sunt ghidate de designul experimental și costul. Considerațiile de proiectare experimentale comune includ luarea în considerare a lungimii secvențierii, adâncimii secvențierii, utilizarea secvențierii individuale față de capătul asociat, numărul de replici, multiplexarea, randomizarea și spike-in-urile. [17]

Secvențierea ARN-ului mic/ARN necodant Edit

Când se secvențiază ARN altul decât ARNm, preparatul din bibliotecă este modificat. ARN-ul celular este selectat pe baza intervalului de dimensiuni dorit. Pentru ținte mici de ARN, cum ar fi miARN, ARN-ul este izolat prin selecția dimensiunii. Acest lucru poate fi realizat cu un gel de excludere a mărimii, prin margele magnetice de selectare a dimensiunii sau cu un kit dezvoltat comercial. Odată izolate, linkerele sunt adăugate la capătul 3 'și 5', apoi purificate. Pasul final este generarea de ADNc prin transcriere inversă.

Secvențierea directă a ARN Edit

Deoarece convertirea ARN în ADNc, ligarea, amplificarea și alte manipulări ale probelor s-au dovedit a introduce prejudecăți și artefacte care pot interfera atât cu caracterizarea corectă, cât și cuantificarea transcrierilor, [18] secvențierea directă a ARN-ului cu o singură moleculă a fost explorată de companii, inclusiv Helicos. (faliment), Oxford Nanopore Technologies, [19] și altele. Această tehnologie secvențează moleculele de ARN direct într-un mod masiv-paralel.

Secvențierea ARN-o singură moleculă în timp real Editează

ARN-Seq direct cu o singură moleculă paralelă masiv a fost explorată ca o alternativă la ARN-Seq tradițional, în care conversia ARN-la-cDNA, ligarea, amplificarea și alte etape de manipulare a probei pot introduce părtiniri și artefacte. [20] Platformele tehnologice care efectuează ARN-Seq cu o singură moleculă în timp real includ secvențierea Nanopore Oxford Nanopore Technologies (ONT), [19] PacBio IsoSeq și Helicos (falimentar). Secvențierea ARN-ului în forma sa nativă păstrează modificări precum metilarea, permițându-le să fie investigate direct și simultan. [19] Un alt beneficiu al ARN-Seq cu o singură moleculă este că transcrierile pot fi acoperite pe întreaga lungime, permițând detectarea și cuantificarea izoformelor de încredere mai mari în comparație cu secvențierea cu citire scurtă. În mod tradițional, metodele ARN-Seq cu o singură moleculă au rate de eroare mai mari în comparație cu secvențierea cu citire scurtă, dar metode mai noi, cum ar fi ONT direct ARN-Seq limitează erorile prin evitarea fragmentării și conversiei cADN. Utilizările recente ale ARN-Seq direct ONT pentru expresia diferențială în populațiile de celule umane au demonstrat că această tehnologie poate depăși multe limitări ale secvențierii ADNc scurte și lungi. [21]

Secvențierea ARN-ului unicelular (scRNA-Seq) Edit

Metode standard, cum ar fi microarrays-urile și analiza standard RNA-Seq în vrac, analizează expresia ARN-urilor din populații mari de celule. În populațiile de celule mixte, aceste măsurători pot ascunde diferențele critice între celulele individuale din aceste populații. [22] [23]

Secvențierea ARN cu o singură celulă (scRNA-Seq) oferă profiluri de expresie ale celulelor individuale. Deși nu este posibil să se obțină informații complete despre fiecare ARN exprimat de fiecare celulă, din cauza cantității mici de material disponibil, modelele de expresie a genelor pot fi identificate prin analize de grupare a genelor. Acest lucru poate descoperi existența unor tipuri rare de celule într-o populație de celule care poate nu s-au mai văzut până acum. De exemplu, celulele rare specializate din plămân numite ionocite pulmonare care exprimă regulatorul de conductanță transmembranară a fibrozei chistice au fost identificate în 2018 de două grupuri care efectuează scRNA-Seq pe epiteliile căilor respiratorii pulmonare. [24] [25]

Proceduri experimentale Edit

Protocoalele scRNA-Seq actuale implică următorii pași: izolarea celulei unice și a ARN-ului, transcrierea inversă (RT), amplificarea, generarea bibliotecii și secvențierea. Celulele unice sunt fie separate mecanic în microgodeuri (de exemplu, BD Rhapsody, Takara ICELL8, Vycap Puncher Platform sau CellMicrosystems CellRaft) sau încapsulate în picături (de exemplu, 10x Genomics Chromium, Illumina Bio-Rad ddSEQ, 1CellBio InDrop Nadia). [26] Celulele unice sunt marcate prin adăugarea de margele cu oligonucleotide codate în bare, ambele celule și mărgele sunt furnizate în cantități limitate, astfel încât co-ocuparea cu mai multe celule și margele este un eveniment foarte rar. Odată ce transcrierea inversă este completă, ADNc-urile din multe celule pot fi amestecate împreună pentru secvențierea transcrierilor dintr-o anumită celulă sunt identificate prin codul de bare unic al fiecărei celule. [27] [28] Identificatorul molecular unic (UMI) poate fi atașat la secvențele țintă mARN/cDNA pentru a ajuta la identificarea artefactelor în timpul pregătirii bibliotecii. [29]

Provocările pentru scRNA-Seq includ păstrarea abundenței relative inițiale de ARNm într-o celulă și identificarea transcriptelor rare. [30] Etapa de transcriere inversă este critică, deoarece eficiența reacției RT determină cât din populația de ARN a celulei va fi analizată în cele din urmă de către secvențiator. Procesivitatea transcriptazelor inverse și strategiile de amorsare utilizate pot afecta producția de ADNc pe toată lungimea și generarea de biblioteci orientate spre capătul 3 ’sau 5’ al genelor.

În etapa de amplificare, fie PCR, fie transcripția in vitro (IVT) este utilizată în prezent pentru a amplifica cADN. Unul dintre avantajele metodelor bazate pe PCR este capacitatea de a genera cADN de lungime completă. Cu toate acestea, eficiența diferită a PCR pe anumite secvențe (de exemplu, conținutul GC și structura snapback) poate fi, de asemenea, amplificată exponențial, producând biblioteci cu acoperire inegală. Pe de altă parte, în timp ce bibliotecile generate de IVT pot evita polarizarea secvenței induse de PCR, secvențele specifice pot fi transcrise ineficient, provocând astfel abandonarea secvenței sau generând secvențe incomplete. [31] [22] Au fost publicate mai multe protocoale scARN-Seq: Tang și colab., [32] STRT, [33] SMART-seq, [34] CEL-seq, [35] RAGE-seq, [36] Cuarț -seq [37] și C1-CAGE. [38] Aceste protocoale diferă în ceea ce privește strategiile pentru transcrierea inversă, sinteza și amplificarea ADNc și posibilitatea de a găzdui coduri de bare specifice secvenței (adică UMI-uri) sau capacitatea de a procesa probe reunite. [39]

În 2017, au fost introduse două abordări pentru a măsura simultan ARNm unicelular și expresia proteinei prin anticorpi marcați cu oligonucleotide, cunoscuți ca REAP-seq, [40] și CITE-seq. [41]

Aplicații Editați

scRNA-Seq este utilizat pe scară largă în toate disciplinele biologice, inclusiv dezvoltarea, neurologia, [42] oncologia, [43] [44] [45] boala autoimună, [46] și boala infecțioasă. [47]

scRNA-Seq a oferit o perspectivă considerabilă asupra dezvoltării embrionilor și a organismelor, inclusiv a viermelui Caenorhabditis elegans, [48] și planaria regenerativă Schmidtea mediterranea. [49] [50] Primele animale vertebrate care au fost cartografiate în acest fel au fost peștii zebră [51] [52] și Xenopus laevis. [53] În fiecare caz, au fost studiate mai multe etape ale embrionului, permițând cartografierea întregului proces de dezvoltare celulă cu celulă. [8] Știința a recunoscut aceste progrese drept descoperirea anului 2018. [54]

Considerații experimentale Editați

O varietate de parametri sunt luați în considerare la proiectarea și efectuarea experimentelor RNA-Seq:

  • Specificitatea tisulară: Expresia genelor variază în interiorul și între țesuturi, iar ARN-Seq măsoară acest amestec de tipuri de celule. Acest lucru poate face dificilă izolarea mecanismului biologic de interes. Secvențierea unei singure celule poate fi utilizată pentru a studia fiecare celulă individual, atenuând această problemă.
  • Dependența de timp: Expresia genei se schimbă în timp, iar ARN-Seq ia doar un instantaneu. Pot fi efectuate experimente de curs de timp pentru a observa schimbările în transcriptom.
  • Acoperire (cunoscută și sub numele de adâncime): ARN-ul găzduiește aceleași mutații observate în ADN, iar detectarea necesită o acoperire mai profundă. Cu o acoperire suficient de mare, ARN-Seq poate fi utilizat pentru a estima expresia fiecărei alele. Acest lucru poate oferi o perspectivă asupra fenomenelor precum imprimarea sau efectele cis-reglementare. Profunzimea de secvențiere necesară pentru aplicații specifice poate fi extrapolată dintr-un experiment pilot. [55]
  • Artefacte de generare a datelor (cunoscute și ca varianță tehnică): Reactivii (de exemplu, trusa de pregătire a bibliotecii), personalul implicat și tipul de secvențiator (de exemplu, Illumina, Pacific Biosciences) pot duce la artefacte tehnice care ar putea fi interpretate greșit ca rezultate semnificative. Ca și în cazul oricărui experiment științific, este prudent să se efectueze ARN-Seq într-un cadru bine controlat. Dacă acest lucru nu este posibil sau studiul este o meta-analiză, o altă soluție este detectarea artefactelor tehnice prin deducerea variabilelor latente (de obicei analiza componentelor principale sau analiza factorilor) și corectarea ulterioară a acestor variabile. [56]
  • Management de date: Un singur experiment ARN-Seq la oameni este de obicei de 1-5 Gb (comprimat) sau mai mult atunci când includ fișiere intermediare. [57] Acest volum mare de date poate pune probleme de stocare. O soluție este comprimarea datelor folosind scheme de calcul multifuncționale (de exemplu, gzip) sau scheme specifice genomicii. Acesta din urmă se poate baza pe secvențe de referință sau de novo. O altă soluție este efectuarea experimentelor de microarray, care pot fi suficiente pentru munca bazată pe ipoteze sau pentru studiile de replicare (spre deosebire de cercetarea exploratorie).

Asamblare transcriptom Editare

Două metode sunt folosite pentru a atribui citiri secvenței brute caracteristicilor genomice (adică, asambla transcriptomul):

  • De novo: Această abordare nu necesită un genom de referință pentru a reconstrui transcriptomul și este de obicei utilizat dacă genomul este necunoscut, incomplet sau modificat substanțial în comparație cu referința. [58] Provocările atunci când se utilizează citiri scurte pentru asamblarea de novo includ 1) determinarea citirilor care ar trebui să fie unite între ele în secvențe contigue (contiguri), 2) robustețe la erori de secvențiere și alte artefacte și 3) eficiență de calcul. Algoritmul principal utilizat pentru asamblarea de novo a trecut de la graficele de suprapunere, care identifică toate suprapunerile în perechi între citiri, la graficele de Bruijn, care împart citirile în secvențe de lungime k și restrâng toți k-merurile într-un tabel hash. [59] Graficele de suprapunere au fost folosite cu secvențierea Sanger, dar nu se ridică bine la milioanele de citiri generate cu RNA-Seq. Exemple de asamblatori care folosesc grafice de Bruijn sunt Trinity, [58] Oases [60] (derivat din asamblatorul genomului Velvet[61] ), Bridger [62] și rnaSPAdes. [63] Secvențierea pereche și citirea lungă a aceluiași eșantion poate atenua deficiențele în secvențierea scurtă a citirii, servind ca șablon sau schelet. Metricele pentru a evalua calitatea unui ansamblu de novo includ lungimea contigului median, numărul de contiguri și N50. [64]
  • Genom ghidat: Această abordare se bazează pe aceleași metode utilizate pentru alinierea ADN-ului, cu complexitatea suplimentară a citirilor de aliniere care acoperă porțiuni non-continue ale genomului de referință. [65] Aceste citiri necontinue sunt rezultatul secvențierii transcrierilor îmbinate (vezi figura). În mod obișnuit, algoritmii de aliniere au doi pași: 1) aliniază porțiuni scurte ale citirii (adică, seminează genomul) și 2) utilizează programarea dinamică pentru a găsi o aliniere optimă, uneori în combinație cu adnotări cunoscute. Instrumentele software care utilizează alinierea ghidată de genom includ Bowtie, [66] TopHat (care se bazează pe rezultatele BowTie pentru alinierea joncțiunilor de îmbinare), [67] [68] Subcitire, [69] STAR, [65] HISAT2, [70] și GMAP . [71] Rezultatele instrumentelor de aliniere (cartare) ghidată de genom pot fi utilizate în continuare de instrumente precum Cufflinks [68] sau StringTie [72] pentru a reconstrui secvențe de transcriere adiacente (adică, un fișier FASTA). Calitatea unui ansamblu ghidat de genom poate fi măsurată atât cu 1) valori de asamblare de novo (de exemplu, N50), cât și cu 2) comparații cu transcrierea cunoscută, joncțiunea de îmbinare, genomul și secvențele de proteine ​​folosind precizie, rechemare, sau combinația lor (de exemplu, scorul F1). [64] În plus, in Silicon evaluarea ar putea fi efectuată folosind citiri simulate. [73] [74]

O notă despre calitatea asamblarii: Consensul actual este că 1) calitatea asamblării poate varia în funcție de metrica utilizată, 2) instrumentele de asamblare care au obținut rezultate bune la o specie nu au neapărat rezultate bune la cealaltă specie și 3) combinarea abordărilor diferite ar putea fi cea mai fiabilă. [75] [76] [77]

Cuantificarea expresiei genelor Edit

Exprimarea este cuantificată pentru a studia modificările celulare ca răspuns la stimuli externi, diferențele dintre stările sănătoase și cele bolnave și alte întrebări de cercetare. Nivelurile de transcriere sunt adesea folosite ca proxy pentru abundența proteinelor, dar acestea nu sunt adesea echivalente din cauza evenimentelor posttranscripționale, cum ar fi interferența ARN și degradarea mediată de nonsens. [78]

Expresia este cuantificată prin numărarea numărului de citiri care au fost mapate la fiecare locus în etapa de asamblare a transcriptomului. Expresia poate fi cuantificată pentru exoni sau gene folosind contigs sau adnotări de referință. [8] Aceste număruri de citiri ARN-Seq observate au fost validate în mod robust împotriva tehnologiilor mai vechi, inclusiv microarrays de expresie și qPCR. [55] [79] Instrumentele care cuantifică numărul sunt HTSeq, [80] FeatureCounts, [81] Rcount, [82] maxcounts, [83] FIXSEQ, [84] și Cuffquant. Aceste instrumente determină numărătoarea de citire din datele ARN-Seq aliniate, dar numărările fără aliniere pot fi obținute și cu Sailfish [85] și Kallisto. [86] Numărările citite sunt apoi convertite în valori adecvate pentru testarea ipotezelor, regresii și alte analize. Parametrii pentru această conversie sunt:

  • Adâncimea / acoperirea secvențierii: Deși adâncimea este pre-specificată atunci când se efectuează mai multe experimente RNA-Seq, aceasta va varia în continuare mult între experimente. [87] Prin urmare, numărul total de citiri generate într-un singur experiment este de obicei normalizat prin conversia numărărilor în fragmente, citiri sau numărători per milion de citiri mapate (FPM, RPM sau CPM). Diferența dintre RPM și FPM a fost derivată în mod istoric în timpul evoluției de la secvențierea unică a fragmentelor la secvențierea cu capăt asociat. În secvențierea cu un singur capăt, există o singură citire pe fragment (adică, RPM = FPM). În secvențierea pereche, există două citiri pe fragment (adică, RPM = 2 x FPM). Adâncimea de secvențiere este uneori denumită dimensiunea bibliotecii, numărul de molecule intermediare de ADNc din experiment.
  • Lungimea genei: Genele mai lungi vor avea mai multe fragmente/citiri/numărări decât genele mai scurte dacă expresia transcriptului este aceeași. Aceasta este ajustată prin împărțirea FPM la lungimea unei caracteristici (care poate fi o genă, o transcriere sau un exon), rezultând fragmentele metrice pe kilobază de caracteristică per milion de citiri mapate (FPKM). [88] Atunci când analizăm grupuri de caracteristici din eșantioane, FPKM este convertit în transcrieri pe milion (TPM) împărțind fiecare FPKM la suma FPKM dintr-un eșantion. [89] [90] [91]
  • Ieșire totală de ARN eșantion: Deoarece din fiecare probă se extrage aceeași cantitate de ARN, probele cu mai mult ARN total vor avea mai puțin ARN per genă. Aceste gene par să aibă o expresie scăzută, rezultând în fals pozitive în analizele din aval. [87] Strategiile de normalizare, inclusiv cuantila, DESeq2, TMM și raportul mediu încearcă să explice această diferență prin compararea unui set de gene exprimate nediferențial între eșantioane și scalarea corespunzătoare. [92]
  • Varianța pentru expresia fiecărei gene: este modelat pentru a ține cont de eroarea de eșantionare (importantă pentru genele cu un număr scăzut de citire), pentru a crește puterea și a reduce valorile false pozitive. Varianța poate fi estimată ca o distribuție binomială normală, Poisson sau negativă [93][94][95] și este adesea descompusă în varianță tehnică și biologică.

Spike-in-uri pentru cuantificarea absolută și detectarea efectelor la nivelul genomului Edit

Spike-in-urile de ARN sunt probe de ARN la concentrații cunoscute care pot fi utilizate ca standarde de aur în proiectarea experimentală și în timpul analizelor din aval pentru cuantificarea absolută și detectarea efectelor la nivelul întregului genom.

  • Cuantificare absolută: Cuantificarea absolută a expresiei genice nu este posibilă în majoritatea experimentelor RNA-Seq, care cuantifică expresia în raport cu toate transcrierile. Este posibil prin efectuarea ARN-Seq cu spike-ins, mostre de ARN la concentrații cunoscute. După secvențiere, numărările de citire ale secvențelor spike-in sunt utilizate pentru a determina relația dintre numărul de citire a fiecărei gene și cantitățile absolute de fragmente biologice [11][96] Într-un exemplu, această tehnică a fost utilizată în Xenopus tropicalis embrioni pentru a determina cinetica transcripției. [97]
  • Detectarea efectelor la nivelul genomului: Modificările în regulatorii globali, inclusiv remodelatorii de cromatină, factorii de transcripție (de exemplu, MYC), complexele de acetiltransferază și poziționarea nucleozomilor nu sunt congruente cu ipotezele de normalizare, iar controalele spike-in pot oferi interpretări precise. [98] [99]

Expresie diferențială Edit

Cea mai simplă, dar adesea cea mai puternică utilizare a ARN-Seq este găsirea diferențelor în expresia genelor între două sau mai multe condiții (de exemplu., tratat vs netratat) acest proces se numește expresie diferențială. Rezultatele sunt denumite frecvent gene exprimate diferențial (DEG), iar aceste gene pot fi fie reglate în sus, fie în jos (adică, mai mare sau mai mic în condiția de interes). Există multe instrumente care efectuează expresia diferențială. Cele mai multe sunt rulate în R, Python sau linia de comandă Unix. Instrumentele utilizate în mod obișnuit includ DESeq, [94] edgeR, [95] și voom + limma, [93] [100] toate acestea fiind disponibile prin R / Bioconductor. [101] [102] Acestea sunt considerațiile obișnuite atunci când se efectuează expresia diferențială:

  • Intrări: Intrările de expresie diferențială includ (1) o matrice de expresie RNA-Seq (gene M x probe N) și (2) o matrice de proiectare care conține condiții experimentale pentru N probe. Cea mai simplă matrice de proiectare conține o coloană, corespunzătoare etichetelor pentru condiția testată. Alte covariabile (denumite și factori, caracteristici, etichete sau parametri) pot include efecte de lot, artefacte cunoscute și orice metadate care ar putea confunda sau media media expresiei genice. În plus față de covariabile cunoscute, covariabilele necunoscute pot fi, de asemenea, estimate prin abordări de supraveghere automată fără supraveghere, inclusiv componente principale, variabile surogate, [103] și analize PEER [56]. Analizele variabile ascunse sunt adesea folosite pentru datele ARN-Seq ale țesutului uman, care au de obicei artefacte suplimentare care nu sunt capturate în metadate (de exemplu., timp ischemic, proveniență de la mai multe instituții, trăsături clinice care stau la baza, colectarea de date de-a lungul mai multor ani cu mult personal).
  • Metode: Cele mai multe instrumente folosesc statistici de regresie sau non-parametrice pentru a identifica genele exprimate diferențial și se bazează fie pe numerele de citire mapate la un genom de referință (DESeq2, limma, edgeR) fie se bazează pe numerele de citire derivate din cuantificarea fără aliniere (sleuth, [104). ] Cuffdiff, [105] Ballgown [106]). [107] În urma regresiei, majoritatea instrumentelor folosesc fie ajustări ale valorii p ale ratei de eroare familiale (FWER), fie ale ratei de descoperire falsă (FDR) pentru a ține cont de ipoteze multiple (în studii la om,

20.000 de gene care codifică proteinele sau

Analizele din aval pentru o listă de gene exprimate diferențial vin în două arome, validând observațiile și făcând inferențe biologice. Datorită capcanelor expresiei diferențiale și ARN-Seq, observațiile importante sunt reproduse cu (1) o metodă ortogonală în aceleași eșantioane (cum ar fi PCR în timp real) sau (2) un alt experiment, uneori preînregistrat, într-o nouă cohortă . Acesta din urmă ajută la asigurarea generalizării și poate fi de obicei urmat de o meta-analiză a tuturor cohortelor grupate. Cea mai comună metodă pentru obținerea unei înțelegeri biologice la nivel superior a rezultatelor este analiza de îmbogățire a setului de gene, deși uneori sunt utilizate abordări genetice candidate. Îmbogățirea setului de gene determină dacă suprapunerea dintre două seturi de gene este semnificativă statistic, în acest caz suprapunerea dintre gene exprimate diferențial și seturi de gene din căi / baze de date cunoscute (de exemplu., Gene Ontology, KEGG, Human Phenotype Ontology) sau din analize complementare în aceleași date (cum ar fi rețelele de co-expresie). Instrumentele comune pentru îmbogățirea setului de gene includ interfețe web (de exemplu., ENRICHR, g:profiler, WEBGESTALT) [114] și pachete software. La evaluarea rezultatelor îmbogățirii, o euristică este să căutați mai întâi îmbogățirea biologiei cunoscute ca o verificare a sănătății și apoi să extindeți domeniul de aplicare pentru a căuta o biologie nouă.

Splicing alternativ Editați

Splicarea ARN-ului este esențială pentru eucariote și contribuie semnificativ la reglarea și diversitatea proteinelor, apărând în & gt90% din genele umane. [115] Există mai multe moduri alternative de splicing: exon jumping (cel mai comun mod de splicing la om și eucariote superioare), exoni reciproc excluzivi, site-uri alternative de donator sau acceptor, retenție intron (modul de splicing cel mai frecvent la plante, ciuperci și protozoare), site-ul alternativ de început al transcrierii (promotor) și poliadenilarea alternativă. [115] Un obiectiv al ARN-Seq este de a identifica evenimente alternative de îmbinare și de a testa dacă diferă între condiții. Secvențierea cu citire lungă captează transcrierea completă și astfel minimizează multe dintre problemele legate de estimarea abundenței izoformelor, cum ar fi cartografierea citirii ambiguă. Pentru ARN-Seq cu citire scurtă, există mai multe metode de detectare a îmbinării alternative care pot fi clasificate în trei grupuri principale: [116] [89] [117]

  • Pe bază de numărare (de asemenea, bazată pe evenimente, îmbinare diferențială): estimate exon retention. Examples are DEXSeq, [118] MATS, [119] and SeqGSEA. [120]
  • Isoform-based (also multi-read modules, differential isoform expression): estimate isoform abundance first, and then relative abundance between conditions. Examples are Cufflinks 2 [121] and DiffSplice. [122]
  • Intron excision based: calculate alternative splicing using split reads. Examples are MAJIQ [123] and Leafcutter. [117]

Differential gene expression tools can also be used for differential isoform expression if isoforms are quantified ahead of time with other tools like RSEM. [124]

Coexpression networks Edit

Coexpression networks are data-derived representations of genes behaving in a similar way across tissues and experimental conditions. [125] Their main purpose lies in hypothesis generation and guilt-by-association approaches for inferring functions of previously unknown genes. [125] RNA-Seq data has been used to infer genes involved in specific pathways based on Pearson correlation, both in plants [126] and mammals. [127] The main advantage of RNA-Seq data in this kind of analysis over the microarray platforms is the capability to cover the entire transcriptome, therefore allowing the possibility to unravel more complete representations of the gene regulatory networks. Differential regulation of the splice isoforms of the same gene can be detected and used to predict their biological functions. [128] [129] Weighted gene co-expression network analysis has been successfully used to identify co-expression modules and intramodular hub genes based on RNA seq data. Co-expression modules may correspond to cell types or pathways. Highly connected intramodular hubs can be interpreted as representatives of their respective module. An eigengene is a weighted sum of expression of all genes in a module. Eigengenes are useful biomarkers (features) for diagnosis and prognosis. [130] Variance-Stabilizing Transformation approaches for estimating correlation coefficients based on RNA seq data have been proposed. [126]

Variant discovery Edit

RNA-Seq captures DNA variation, including single nucleotide variants, small insertions/deletions. and structural variation. Variant calling in RNA-Seq is similar to DNA variant calling and often employs the same tools (including SAMtools mpileup [131] and GATK HaplotypeCaller [132] ) with adjustments to account for splicing. One unique dimension for RNA variants is allele-specific expression (ASE): the variants from only one haplotype might be preferentially expressed due to regulatory effects including imprinting and expression quantitative trait loci, and noncoding rare variants. [133] [134] Limitations of RNA variant identification include that it only reflects expressed regions (in humans, <5% of the genome), could be subject to biases introduced by data processing (e.g., de novo transcriptome assemblies underestimate heterozygosity [135] ), and has lower quality when compared to direct DNA sequencing.

RNA editing (post-transcriptional alterations) Edit

Having the matching genomic and transcriptomic sequences of an individual can help detect post-transcriptional edits (RNA editing). [3] A post-transcriptional modification event is identified if the gene's transcript has an allele/variant not observed in the genomic data.

Fusion gene detection Edit

Caused by different structural modifications in the genome, fusion genes have gained attention because of their relationship with cancer. [136] The ability of RNA-Seq to analyze a sample's whole transcriptome in an unbiased fashion makes it an attractive tool to find these kinds of common events in cancer. [4]

The idea follows from the process of aligning the short transcriptomic reads to a reference genome. Most of the short reads will fall within one complete exon, and a smaller but still large set would be expected to map to known exon-exon junctions. The remaining unmapped short reads would then be further analyzed to determine whether they match an exon-exon junction where the exons come from different genes. This would be evidence of a possible fusion event, however, because of the length of the reads, this could prove to be very noisy. An alternative approach is to use paired-end reads, when a potentially large number of paired reads would map each end to a different exon, giving better coverage of these events (see figure). Nonetheless, the end result consists of multiple and potentially novel combinations of genes providing an ideal starting point for further validation.

RNA-Seq was first developed in mid 2000s with the advent of next-generation sequencing technology. [139] The first manuscripts that used RNA-Seq even without using the term includes those of prostate cancer cell lines [140] (dated 2006), Medicago truncatula [141] (2006), maize [142] (2007), and Arabidopsis thaliana [143] (2007), while the term "RNA-Seq" itself was first mentioned in 2008 [144] The number of manuscripts referring to RNA-Seq in the title or abstract (Figure, blue line) is continuously increasing with 6754 manuscripts published in 2018. The intersection of RNA-Seq and medicine (Figure, gold line) has similar celerity. [145]

Applications to medicine Edit

RNA-Seq has the potential to identify new disease biology, profile biomarkers for clinical indications, infer druggable pathways, and make genetic diagnoses. These results could be further personalized for subgroups or even individual patients, potentially highlighting more effective prevention, diagnostics, and therapy. The feasibility of this approach is in part dictated by costs in money and time a related limitation is the required team of specialists (bioinformaticians, physicians/clinicians, basic researchers, technicians) to fully interpret the huge amount of data generated by this analysis. [146]

Large-scale sequencing efforts Edit

A lot of emphasis has been given to RNA-Seq data after the Encyclopedia of DNA Elements (ENCODE) and The Cancer Genome Atlas (TCGA) projects have used this approach to characterize dozens of cell lines [147] and thousands of primary tumor samples, [148] respectively. ENCODE aimed to identify genome-wide regulatory regions in different cohort of cell lines and transcriptomic data are paramount in order to understand the downstream effect of those epigenetic and genetic regulatory layers. TCGA, instead, aimed to collect and analyze thousands of patient's samples from 30 different tumor types in order to understand the underlying mechanisms of malignant transformation and progression. In this context RNA-Seq data provide a unique snapshot of the transcriptomic status of the disease and look at an unbiased population of transcripts that allows the identification of novel transcripts, fusion transcripts and non-coding RNAs that could be undetected with different technologies.

This article was submitted to WikiJournal of Science for external academic peer review in 2019 (reviewer reports). The updated content was reintegrated into the Wikipedia page under a CC-BY-SA-3.0 license ( 2021 ). The version of record as reviewed is: Felix Richter et al. (17 May 2021). "A broad introduction to RNA-Seq". WikiJournal of Science. 4 (2): 4. doi:10.15347/WJS/2021.004. ISSN 2470-6345. Wikidata Q100146647.


1 An introduction to statistics

1.3 Why biologists have to repeat everything

1.4 Why biologists have to bother with statistics

1.5 Why statistical logic is so strange

1.6 Why there are so many statistical tests

1.7 Using the decision chart

2 Dealing with variability

2.2 Examining the distribution of data

2.3 The normal distribution

2.4 Describing the normal distribution

2.5 The variability of samples

2.7 Presenting descriptive statistics and confidence limits

2.8 Introducing computer programs

2.9 Calculating descriptive statistics

2.10 Self-assessment problems

3 Testing for normality and transforming data

3.1 The importance of normality testing

3.3 What to do if your data has a significantly different distribution from the normal

3.4 Examining data in practice

3.6 The complete testing procedure

3.7 Self-assessment problems

4 Testing for differences from an expected value or between two groups

4.2 Why we need statistical tests for differences

4.3 How we test for differences

4.4 One- and two-tailed tests

4.5 The types of t test and their non-parametric equivalents

4.9 Introduction to non-parametric tests for differences

4.10 The one-sample sign test

4.11 The Wilcoxon matched pairs test

4.12 The Mann–Whitney U test

4.13 Self-assessment problems

5 Testing for differences between more than two groups: ANOVA and its non-parametric equivalents

5.3 Deciding which groups are different – post hoc tests

5.4 Presenting the results of one-way ANOVAs

5.5 Repeated measures ANOVA

5.6 The Kruskal–Wallis test

5.9 The Scheirer–Ray–Hare Test

5.11 Self-assessment problems

6 Investigating relationships

6.2 Examining data for relationships

6.5 Statistical tests for linear relationships

6.8 Studying common non-linear relationships

6.9 Dealing with non-normally distributed data: rank correlation

6.10 Self-assessment problems

7 Dealing with categorical data

7.2 The problem of variation

7.3 The x2 test for differences

7.4 The x2 test for association

7.7 Self-assessment problems

8.3 Excluding confounding variables

8.4 Replication and pseudoreplication

8.5 Randomisation and blocking

8.6 Choosing the statistical test

8.7 Choosing the number of replicates: power calculations

8.8 Dealing with your results

8.9 Self-assessment problems

9 More complex statistical analysis

9.1 Introduction to complex statistics

9.2 Experiments investigating several factors

9.3 Experiments in which you cannot control all the variables

9.4 Investigating the relationships between several variables

9.5 Exploring data to investigate groupings

10 Presenting and writing about statistics

10.1 Introduction – less is more!

10.2 The introduction section

10.5 The discussion section

10.6 The abstract or summary

Table S1: Critical values for the t statistic

Table S2: Critical values for the correlation coefficient r

Table S3: Critical values for the x2 statistic

Table S4: Critical values for the Wilcoxon T distribution

Table S5: Critical values for the Mann–Whitney U distribution

Table S6: Critical values for the Friedman x2 distribution

Table S7: Critical values for the Spearman rank correlation coefficient r


Sample Preparation with Nanomaterials. Next Generation Techniques and Applications. Edition No. 1

Sample Preparation with Nanomaterials: Next Generation Techniques for Sample Preparation delivers insightful and complete overview of recent progress in the use of nanomaterials in sample preparation. The book begins with an overview of special features of nanomaterials and their applications in analytical sciences. Important types of nanomaterials, like carbon nanotubes and magnetic particles, are reviewed and biological sample preparation and lab-on-a-chip systems are presented.

The distinguished author places special emphasis on approaches that tend to green and reduce the cost of sample treatment processes. He also discusses the legal, economical, and toxicity aspects of nanomaterial samples. This book includes extensive reference material, like a complete list of manufacturers, that makes it invaluable for professionals in analytical chemistry.

Sample Preparation with Nanomaterials offers considerations of the economic aspects of nanomaterials, as well as the assessment of their toxicity and risk. Readers will also benefit from the inclusion of:

  • A thorough introduction to nanomaterials in the analytical sciences and special properties of nanomaterials for sample preparation
  • An exploration of the mechanism of adsorption and desorption on nanomaterials, including carbon nanomaterials used as adsorbents
  • Discussions of membrane applications of nanomaterials, surface enhanced raman spectroscopy, and the use of nanomaterials for biological sample preparation
  • A treatment of magnetic nanomaterials, lab-on-a-chip nanomaterials, and toxicity and risk assessment of nanomaterials

Perfect for analytical chemists, materials scientists, and process engineers, Sample Preparation with Nanomaterials: Next Generation Techniques for Sample Preparation will also earn a place in the libraries of analytical laboratories, universities, and companies who conduct research into nanomaterials and seek a one-stop resource for sample preparation.

1 Nanomaterials (NMs) in Analytical Sciences
1.1 Introduction
1.2 Types of NMs
1.3 Applications of NMs
1.4 Conclusions
Referințe

2 Special Properties of Nanomaterials (NMs) for SamplePreparation
2.1 Introduction
2.2 Mechanical Properties of NMs
2.3 Thermal Properties of NMs
2.4 Electrical Properties of NMs
2.5 Optical Properties of NMs
2.6 Magnetic Properties of NMs
2.7 Adsorption Properties of NMs
2.8 Conclusions
Referințe

3 Adsorption Mechanism on Nanomaterials (NMs)
3. 1Introduction
3.2 Adsorption Process
3.3 Conclusions and Future Perspective
Referințe

4 Carbon Nanomaterials (CNMs) as Adsorbents for SamplePreparation
4.1 Introduction
4.2 Carbon Nanomaterials (CNMs)
4.3 Adsorption on CNMs
4.4 Applications of CNMs
4.5 Conclusions
Referințe

5 Membrane Applications of Nanomaterials (NMs)
5.1 Introduction935.2Traditional Membranes
5.2 Traditional Membranes
5.3 Carbon Nanomaterial-based Membranes
5.4 Nanoparticle-based Membranes
5.5 Molecularly Imprinted Polymer (MIP)-based Membranes
5.6 Conclusions
Referințe

6 Surface-Enhanced Raman Spectroscopy (SERS) withNanomaterials (NMs)
6.1 Introduction
6.2 Theory of SERS
6.3 SERS Mechanisms
6.4 Determination of SERS Enhancement Factor
6.5 Selection Rules
6.6 Fabrications of SERS Substrates
6.7 Applications of SERS
6.8 Conclusions
Referințe

7 Nanomaterials (NMs) for Biological Sample Preparations
7.1 Introduction
7.2 The Use of NMs in Diagnostic Platforms
7.3 NMs-based Lab-on-a-chip (LOC) Platforms
7.4 Biomedical Applications of NMs
7.5 Sensor Applications of NMs
7.6 Conclusions

8 Magnetic Nanomaterials for Sample Preparation
8.1 Introduction
8.2 Synthesis of Magnetic Nanoparticles
8.3 Solid-Phase Extraction (SPE)
8.4 Magnetic Solid-Phase Extraction (MSPE)
8.5 Conclusions and Future Trends
Referințe

9 Lab on Chip with Nanomaterials (NMs)
9.1 Introduction
9.2 Lab-on-a-Chip (LOC) Concept
9.3 NM-Based LOC Platforms
9.4 Conclusions and Future Perspectives
Referințe

10 Toxicity and Risk Assessment of Nanomaterials
10.1 Introduction
10.2 Hazard Assessment of Nanomaterials
10.3 Toxicity Mechanism of Nanomaterials
10.4 The Traditional Risk Assessment Paradigm
10.5 Strategies for Improving Specific Risk Assessment
10.6 Conclusions
Referințe

11 Economic Aspects of Nanomaterials (NMs) for SamplePreparation
11.1 Introduction
11.2 Toxicity Concerns of NMs
11.3 Global Market for NM-Based Products
11.4 Conclusions
Referințe

12 Legal Aspects of Nanomaterials (NMs) for SamplePreparation
12.1 Introduction
12.2 Safety Issues of NMs
12.3 Regulatory Aspects of NMs
12.4 Conclusions
Referințe

13 Monitoring of Nanomaterials (NMs) in the Environment
13.1 Introduction
13.2 Toxicity and Safety Concerns of NMs
13.3 Main Sources and Transport Routes of Nanopollutants
13.4 Requirements of Analytical Approaches
13.5 Sampling of NMs in Environmental Samples
13.6 Separation of NMs in Environmental Samples
13.7 Detection Techniques for the Characterization of NMs
13.8 Conclusions
Referințe

14 Future Prospect of Sampling
14.1 Introduction
14.2 Sampling
14.3 Sample Preparation
14.4 Green Chemistry
14.5 Miniaturization of Analytical Systems
14.6 Conclusions
Referințe


4. Discutie

Given the urgent need to control the COVID-19 pandemic, vaccine development is being accelerated into the clinical trials phase [4] , [7] , [8] , even though understanding of the immunologic features of the antigens of SARS-CoV-2 remains poor. In this phase I trial, a study was performed to investigate the safety and immunogenicity of this inactivated vaccine in 191 subjects. The data collected show several notable features. First, the clinical safety observations among the 191 subjects suggest that there were no severe adverse reactions related to vaccination, and the most frequently reported events were mild, including redness, itching and swelling at the inoculation site and a few cases of slight fatigue there were no significant differences between the vaccine and control groups. These data support the clinical safety of this vaccine. However, based on the current concern about the possibility of immunopathology due to SARS-Cov-2 infection [16] , we extended our safety observations to the investigation of variations in immune cell populations and cytokine levels in the peripheral blood. The test results suggested that there were no abnormalities in most of the 48 detected cytokines and the proportions of immune cells. Second, not only did serological detection show the presence of neutralizing antibodies, antibodies against the S protein, the N protein and the complete virion antigens were also found in ELISA assays to have been elicited in the vaccinated population, and there were dynamic alterations in the levels of these antibodies based on the dose and the vaccination schedule. However, the medium and high doses in both the 0, 14 and 0, 28 schedule groups led to 100% seroconversion of ELISA anti-S antibody after two inoculations, and interestingly, the medium dose group assigned to the 0, 14 schedule reached 100% seroconversion of the neutralizing antibody with the highest GMT value. However, the high-dose group exhibited lower seroconversion and GMT values. According to our understanding, this result might be due to the medium dose providing suitable signal stimulation to the immune system or the limited sample size. Therefore, further investigations in phase II and III trials are necessary. Additionally, the neutralizing antibody can neutralize different pandemic strains with diverse mutations. However, the GMT of neutralizing antibodies measured in this trial is obviously lower than the GMTs observed in the trials of mRNA vaccines developed by Moderna and Pfizer [17] , [18] this difference suggests that characteristic immune responses are elicited by mRNA vaccines and vaccines against the inactivated virus and that these vaccines should be evaluated based upon their clinical protective efficacy [19] . At the time of the antibody response, a CTL response with IFN-gamma specificity against the S, N and virion antigens was detected in immunized individuals in comparison with individuals receiving the placebo this suggests that any one of these three antigens enables the specific activation of T cells even if the immune response does not show dose-dependent effects. These immunological indexes indicate that a systemic immune response was elicited by our vaccine in the human population. To examine the genetic diversity of the specific immunity elicited by the vaccine, we examined the mRNA gene profile of the PBMCs from vaccinated individuals and found that most of the expressed mRNA genes were related to various signaling pathways of the innate and adaptive immune systems, and the immune functions were upregulated in comparison with the placebo group. Here, activation of the multiple signaling pathways involved in the immune response resulted in variations in hundreds of genes related to activation of innate immunity at day 7 after booster immunization regardless of the immunization schedule however, the cytokines that were found to have elevated levels in COVID-19 patients had only mild variations and were at levels similar to those in the placebo control group, which corresponded with those detected in the serum. The activation of genes related to T cells, B cells, DCs and mononuclear cells/macrophages with varying dynamics is evidence of the immune resonse elicited by the vaccine. All the data obtained in this trial support the safety and immunogenicity of this inactivated vaccine and are encouraging with regard to further studies of its efficacy in the future.

A limitation of this study is the lack of analysis of the protective efficacy of the vaccine and the lack of a comparative transcriptional analysis of PBMCs from vaccinated individuals and COVID-19 patients the latter comparison was not possible because few blood samples have been obtained from COVID-19 patients in mainland China at this time.


The Exams

The external assessment

The IB uses a criterion based approach to assessment. This means that students work is judged against identified levels of attainment and not against the work of other students. At the grade award meeting which takes place once all the papers have been marked levels of attainment, in the form of grade boundaries are agreed. There is consideration of the difficulty of the exams and the performance of students and a committee of people are involved.

Several methods of assessment are used: Assessment criteria when the task in open ended, Markbands with a range of level descriptors used to judge students answers to some extended response questions, Analytic markschemes where a particular kind of response is required, and Marking notes are used to clarify assessment criteria.

Examiners are monitored throughout the marking process and ever effort is made to ensure consistency in marking.

Standard Level

Multiple choice questions are quite challenging and students need practice with the style.

Each question has a "distractor" or answer which is almost correct. Usually one or two answers are quite obviously wrong.

The data analysis questions at the beginning of this paper require good skills in the interpretation of graphs but also an ability to cope with unfamiliar material.

The short answer questions are the least complicated part of the external assessment. If a student knows the biology these questions resemble the work a student often does using text books and worksheets in lessons. The challenge is to be prepared to answer questions on any part of the IB Biology guide.

There is a choice of two extended response questions, students must answer all three sections of one question. Care is required in reading the questions, in particular the command term so that students give the right sort of answers. Often there is one part which requires a diagram.

Historically, many students find this exam easier than paper 2 because there is less syllabus coverage and students can prepare more thoroughly for the option material. There are two or three questions in section A which will test knowledge of practical experiment skills and analysis of results from any part of the core topics and the prescribed experiments. Section B resembles the short answer section of paper 2 except that it covers only material from the chosen option. Students should be trained in choosing the correct option and only answering questions from one option.

Internal Assessment

This investigation is assessed by the teacher in school and a sample of work is moderated by the IB and adjustments made to marks so that all centres are awarding marks in a similar standard. For further details see The Investigation pages.

Higher Level

Although the length of all the exams for HL is longer than the SL exams, the structure of all examinations and the investigation is the same as for SL.

The only exception is in Paper 2 where students will have a choice of two out of three extended response questions. The weighting of paper two is slightly less that the SL paper 2 to allow for assessment of the extra HL material in the option paper.


Riffle Sample Splitters with chutes

Riffle sample Splitters, also called Sample Dividers with Chutes, allow dividing samples into two representative subsamples with a good accuracy.

Riffle Sample Splitter is the most universally used sampling device for preparing representative splits of dry, free-flowing granular product.

The technique is rapid and the equipment is economical.

It is precisely designed to reduce the bulk of material to a convenient representative size for laboratory analysis. When used properly, it provides an accuracy that is recognized through out the industry

With Riffle Sample Splitters, a homogenous, dry, free-flowing sample is poured evenly into the hopper / funnel. The material flows through the alternately arranged passages in the opposite direction (chutes / riffle bank) into the two collecting pans under the dividing head outlets. With every operation the feed sample is divided in two representative subsamples. The operation can be repeated as many times as necessary, until the required dividing quantity has been obtained.


8.3: Sample preparation - Biology

There are two methods to transform E coli cells with plasmid DNA - chemical transformation and electroporation. For chemical transformation, cells are grown to mid-log phase, harvested and treated with divalent cations such as CaCl2. Cells treated in such a way are said to be competent. To chemically transform cells, competent cells are mixed with the DNA , on ice, followed by a brief heat shock. Then, cells are incubated with rich medium and allowed to express the antibiotic resistant gene for 30-60 minutes prior to plating. For electroporation, cells are also grown to mid-log phase but are then washed extensively with water to eliminate all salts. Usually, glycerol is added to the water to a final concentration of 10% so that the cells can be stored frozen and saved for future experiments. To electroporate DNA into cells, washed E coli are mixed with the DNA to be transformed and then pipetted into a plastic cuvette containing electrodes. A short electric pulse, about 2400 volts/cm, is applied to the cells causing smalls holes in the membrane through which the DNA enters. The cells are then incubated with broth as above before plating.

For chemical transformation, there is no need to pre-treat the DNA. For electroporation, the DNA must be free of all salts so the ligations are first precipitated with alcohol before they are used.

Proiectare experimentală :

To determine the efficiency of transformation, a positive control transformation should be done using 1 ng of uncut plasmid DNA, e.g. pUC19. The efficiency of transformation is calculated as the number of transformants/&mug of input DNA. A negative control should also be included that contains cells with no added DNA.

A negative control with cells only (no added DNA) should also be included.

For most cloning applications, we use DH5&alpha host cells. These cells are compatible with lacZ blue/white selection procedures, are easily transformed, and good quality plasmid DNA can be recovered from transformants. One notable exception is when transforming with plasmid constructs containing recombinant genes under control of the T7 polymerase. These constructs are typically transformed into DH5&alpha for the cloning phase, but need to be transformed into a different bacterial strain, BL21(DE3) for expression of the recombinant protein (BL21 strains carry the gene for expression of the T7 polymerase).

Electroporation of E coli:

  • Sterile centrifuge bottles &ndash 250 ml for GSA rotor
  • SOB medium
  • E coli host strain such as DH5&alpha
  • WB (10% redistilled glycerol, 90% distilled water, v/v) chilled to 4°C&ndash need 500 ml of WB for each 250 ml of culture
  • tRNA (5-10 µg/ml &ndash used as a mass carrier to increase the efficiency of precipitation)
  • 5 M ammonium acetate
  • 100% ethanol
  • 70% ethanol
  • 0.5X TE or EB (10 mM Tris, pH 8.3)
  • SOC medium
  • transformation plates

I. Preparation of E coli cells for electroporation.

1. Use a fresh colony of DH5&alpha (or other appropriate host strain) to inoculate 5 ml of SOB (without magnesium) medium in a 50 ml sterile conical tube. Grow cells with vigorous aeration overnight at 37°C.

2. Dilute 2.5 ml of cells into 250 ml of SOB (without magnesium) in a 1 liter flask. Grow for 2 to 3 hours with vigorous aeration at 37°C until the cells reach an OD550 = 0.8.

3. Harvest cells by centrifugation at 5000 RPM in a GSA rotor for 10 min in sterile centrifuge bottles. (Make sure you use autoclaved bottles!).

4. Wash the cell pellet in 250 ml of ice-cold WB as follows. First, add a small amount of WB to cell pellet pipet up and down or gently vortex until cells are resuspended. Then fill centrifuge bottle with ice cold WB and gently mix. NOTE- the absolute volume of WB added at this point is not important.

5. Centrifuge the cell suspension at 5,000 RPM for 15 min and carefully pour off the supernatant as soon as the rotor stops. Cells washed in WB do not pellet well. If the supernatant is turbid, increase the centrifugation time.

6. Wash the cell pellet a second time by resuspending in 250 ml of sterile ice-cold WB using the same technique described above. Centrifuge the cell suspension at 5000 RPM for 15 min.

7. Gently pour off the supernatant leaving a small amount of WB in the bottom of the bottle. Resuspend the cell pellet in the WB - no additional WB needs to be added &ndash and the final volume should be about 1 ml. Cells can be used immediately or can be frozen in 0.2 ml aliquots in freezer vials using a dry ice-ethanol bath. Store frozen cells at -70°C.

II. Preparing DNA for Electroporation

DNA for electroporation must have a very low ionic strength and a high resistance. The DNA may be purified by either dilution, precipitation or dialysis.

  • For transformation of purified plasmid DNA, dilute DNA in 10 mM Tris pH 8-8.3 to about 1-50 ng/µl (do not use TE). Use 1 µl for transformation.
  • For ligation reactions, use the following procedure.

Purifying DNA by Precipitation:

1. Add 5 to 10 &mug of tRNA to a 20 &mul ligation reaction in a 1.5 ml tube. Add 22 &mul 5M ammonium acetate (or an equal volume of ligation reaction with added tRNA). Amesteca bine.

2. Add 100 &mul absolute ethanol (or 2.5 volumes of ligation reaction, tRNA and salt). Ice 15 min.

3. Centrifuge at >12,000 x g for 15 min at 4°C. Carefully decant the supernatant.

4. Wash the pellet with 1 ml of 70% ethanol. Centrifuge at >12,000 x g for 15 min at room temperature. Remove the supernate.

5. Air dry the pellet (speed vac okay but don't overdry).

6. Resuspend the DNA in EB buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.3) or 0.5X TE buffer [5 mM Tris-HCl, 0.5 mM EDTA (pH 7.5)] to a concentration of 10 ng/ul of DNA. For ligation reactions, it is convenient to resuspend in 10 µl. Use 1 &mul per transformation of 20 &mul of cell suspension.

III. Electroporation.

1. Mark the required number of micro centrifuge tubes. Place the required number of Micro-electroporation Chambers on ice. Fill the temperature control compartment of the Chamber Safe with

250 ml of ice-water slurry and place the Chamber Rack in the Chamber Safe.

2. Thaw an aliquot of cells that have prepared as in Section I and aliquot 20 µ l of cells to the required number of microfuge tubes on ice. Add 1 µ l of the DNA (or ligation reaction) prepared as in Section II.

3. Using a micro pipette, pipette 20 µ l of the cell-DNA mixture between the bosses in a Micro-Electroporation Chamber. Do not leave an air bubble in the droplet of cells the pressure of a bubble may cause arcing and loss of the sample. Place the chamber in a slot in the Chamber Rack and note its position. Repeat the process if more than one sample is to be pulsed. Up to 4 samples can be placed in the Chamber Rack at one time. Handle the chambers gently to avoid accidentally displacing the sample from between the bosses.

4. Close the lid of the Chamber safe and secure it with the draw latch.

5. Plug the pulse cable into the right side of the Chamber safe.

6. Turn the chamber selection knob on top of the Chamber Safe to direct the electrical pulse to the desired Micro-Electroporation Chamber.

7. Set the resistance on the Voltage Booster to 4 k&Omega set the Pulse Control unit to LOW and 330 µ F double check connections.

8. Charge the Pulse Control unit by setting the CHARGE ARM switch on the Pulse Control unit to CHARGE and then pressing the UP voltage control button until the voltage reading is 5 to 10 volts higher than the desired discharge voltage. Pentru E coli, the standard conditions are 2.4 kv, which means setting the Pulse Control unit to 405 volts (400 volts is the desired discharge voltage + 5). The voltage booster amplifies the volts by

6-fold such that the total discharge voltage is 2400 volts, or 2.4 kv. The actual peak voltage delivered to the sample will be shown on the Voltage Booster meter după the pulse is delivered.

9. Set the CHARGE/ARM switch to the ARM position. The green light indicates that the unit is ready to deliver a DC pulse. Depress the pulse discharge TRIGGER button and hold for 1 second.

NOTE: The DC voltage display on the Pulse Control unit should read <10 volts after a pulse has been delivered. If not, discharge the capacitor using the DOWN button.

10. For additional samples, turn the chamber selection knob to the next desired position and repeat steps 8 and 9 until all samples are pulsed.

11. For ampicillin selection, inoculate the samples into 2 ml of SOC medium and shake for 30 minutes (for amp), 60 minutes (for Kan) to allow expression of the antibiotic gene. Plate cells on LB medium with appropriate antibiotic or screening reagent (e.g. 100 µg/ml ampicillin, and/or 40 &mul of 20 mg/ml X-Gal, XP, and 40 &mul of 100 mM IPTG) .

This Web page is maintained by Julie B. Wolf, UMBC
Last updated on 3/2/2010

is designed for students interested in careers in industrial and biomedical sciences.


Priveste filmarea: Co widzi mikroskop elektronowy? Jak badamy próbki? (Ianuarie 2022).