Informație

Acizii nucleici cu catenă dublă sunt mai „durabili” decât acizii nucleici cu catenă simplă?


Mă lupt cu o întrebare care mi s-a pus.

„De ce este materialul genetic dublu catenar mai„ durabil ”decât cel cu un singur catenar?”

Știu că materialul genetic dublu catenar este mai stabil datorită multor fire. Catenă simplă nu este la fel de stabilă ca catenă dublă, deoarece îi lipsește cea de-a doua catenă și, prin urmare, bazele sunt deschise.

Stabil nu este același lucru cu durabil și nu am auzit niciodată în clasă că unul este mai durabil decât celălalt. Mi-a fost dor de ceva sau este doar o greșeală?


Eu interpretez „durabilitate” ca fiind rezistența ADN-ului la stres fizic, cum ar fi forfecarea. Laboratorul Bustamante de la UC Berkeley face o mulțime de biofizică foarte rece cu o singură moleculă, analizând forțele implicate în interacțiunile proteină-proteină și interacțiunile proteină-ADN. Acest Bustamante et al. Lucrarea de revizuire, Studiile cu o singură moleculă ale mecanicii ADN-ului includ o privire asupra forței necesare pentru a sparge ssDNA și dsDNA:

Molecule unice de ADNds au fost sparte cu un menisc de apă în retragere [26] la forțe estimate la 960 pN (corectarea modulului lui Young dublează forța de sciziune publicată de 480 pN). Moleculele ADN-uri scurte trase cu un vârf AFM [27] au susținut forțe peste 1700 pN.

pN = picoNewton
AFM = microscopia forței atomice

dsDNA este mai rezistent la forțele de întindere / forfecare, deoarece dispunerea dublei spirale este „elastică”. Vă recomand să citiți ziarului pentru mai multe informații. Lucruri foarte mișto.


Recunoașterea înnăscută a acizilor nucleici non-auto

Sistemul imunitar a dezvoltat o multitudine de receptori înnăscuți care detectează ADN-ul și ARN-ul microbian, inclusiv receptorii Toll-like din compartimentul endozomal și receptorii RIG-I-like și receptorii Nod-like din citosol. Aici discutăm despre recunoașterea și răspunsurile la acizii nucleici non-auto prin intermediul acestor receptori, precum și implicarea lor în bolile autoimune.

Funcția sistemului imunitar este de a proteja organismul de agenții patogeni invadatori. Pentru a evita deteriorarea colaterală a țesuturilor proprii ale corpului, acesta trebuie să fie capabil să distingă entitățile infecțioase care nu sunt de sine de țesuturile de sine. Limfocitele specifice antigenului - celulele T și celulele B - recunosc agenții patogeni prin receptorii celulelor T și, respectiv, imunoglobulinele, care sunt generate de rearanjarea genelor somatice. Dar, deși acești receptori specifici antigenului permit recunoașterea unui număr mare de molecule diferite, nu au nicio capacitate intrinsecă de a distinge non-sinele de sine. În schimb, se crede că semnalele furnizate prin așa-numiții receptori de recunoaștere a modelului ai sistemului imunitar înnăscut sunt fundamentale în recunoașterea entităților infecțioase non-self, pregătind astfel organismul pentru inițierea unui răspuns imunitar complet specific antigenului care vizează agenții patogeni invadatori. dar nu și țesuturile proprii [1]. Receptorii utilizați de sistemul imunitar înnăscut recunosc componentele microbiene, cunoscute sub denumirea de modele moleculare asociate cu agenții patogeni, care sunt esențiale pentru supraviețuirea microorganismului și, prin urmare, este dificil de modificat. Diferiți receptori interacționează cu diferite molecule de patogen și prezintă modele de expresie distincte, activează căi de semnalizare specifice și conduc la răspunsuri anti-patogen distincte [2, 3]. Moleculele recunoscute includ, de exemplu, componente ale pereților celulari bacterieni și fungici, proteine ​​flagelare și proteine ​​virale de suprafață - molecule care sunt unice pentru agentul patogen și nu se găsesc în gazdă. Un alt grup major de molecule patogene recunoscute în mod specific de receptorii imuni înnăscuti cuprinde ADN microbian și ARN. Deoarece acizii nucleici sunt prezenți în toate organismele, gazda a dezvoltat mecanisme specializate pentru recunoașterea acizilor nucleici non-auto, menținând în același timp toleranța (non-receptivitatea) la acizii auto-nucleici. În acest articol, vom analiza mai multe sisteme de receptori de recunoaștere a modelelor implicați în recunoașterea acizilor non-auto-nucleici, inclusiv receptorii Toll-like (TLR), receptorii asemănători genei I (RIG-I) inducibile de acid retinoic (RLRs) și receptorii de tip Nod (NLRs) (Tabelul 1). Cu toate acestea, mecanismele de recunoaștere a acizilor nucleici non-auto nu sunt sigure, iar în condiții anormale are loc recunoașterea ADN-ului și ARN-ului propriu, ceea ce duce la dezvoltarea autoimunității. Acest lucru este discutat în ultima secțiune a acestei revizuiri.


Abstract

Nanoporii în stare solidă oferă o metodă promițătoare pentru sondarea rapidă a proprietăților structurale ale biopolimerilor precum ADN și ARN. Am translocat pentru prima dată molecule de ARN prin nanopori în stare solidă, comparând semnăturile translocării moleculelor de ARN dublu catenar și ale homopolimerilor monocatenari poli (A), poli (U), poli (C). Pe baza curenților lor de blocare diferențială, putem discrimina rapid atât moleculele de acid nucleic monocatenar, cât și dublu catenar, precum și homopolimerii pe bază de purină separați de homopolimerii pe bază de pirimidină. Identificarea moleculelor este facilitată prin aplicarea unor tensiuni ridicate (~ 600 mV), care contribuie la întinderea entropică a acestor molecule extrem de flexibile. Această sensibilitate izbitoare la diferențele relativ mici în structura polimerului de bază îmbunătățește foarte mult perspectivele de utilizare a dispozitivelor bazate pe nanopori pentru cartografierea ADN-ului sau ARN-ului.


UTILIZAREA OLIGOCALC PENTRU CALCULAREA PROPRIETĂȚILOR OLIGONUCLEOTIDELOR

OligoCalc are o interfață familiară de „calculator”, iar proprietățile de bază pot fi calculate prin lipirea sau introducerea secvenței, urmată de una dintre următoarele acțiuni: făcând clic în afara casetei de secvență, introducerea unei „fili”, apăsând „întoarcere” sau făcând clic pe „Calculați”. '. OligoCalc va folosi secvența introdusă în prezent, opțiunile selectate și condițiile introduse pentru a calcula lungimea, greutatea moleculară, absorbanța estimată la 260 nm, concentrația micromolară și microgramele de oligonucleotidă prezente într-o soluție de 1 ml cu o absorbanță de una pentru secvența introdusă. Calculatorul este disponibil la adresa URL http://basic.northwestern.edu/biotools/OligoCalc.html și încărcarea URL-ului respectiv într-un browser va afișa interfața prezentată în Figura 1.

Ecranul de intrare și de calcul principal pentru OligoCalc.

Ecranul de intrare și de calcul principal pentru OligoCalc.

Odată ce utilizatorul a introdus o secvență, pot fi selectate sau introduse mai multe opțiuni suplimentare. Absorbanța la 260 nm (A260) poate fi introdusă pentru oligonucleotidă și va avea ca rezultat calcularea concentrației micromolare a oligonucleotidei, precum și a microgramelor oligonucleotidei prezente într-o soluție de 1 ml cu această absorbanță. Concentrația milimolară a sării [Na +] poate fi introdusă și va regla calculul temperaturii de topire ajustat și cel mai apropiat al sării. Valoarea implicită este de 50 mM. Concentrația nanomolară a primerului în soluția de hibridizare poate fi, de asemenea, introdusă și va regla cea mai apropiată temperatură de topire vecină. Compoziția oligonucleotidei (ADN sau ARN, monocatenare sau bicatenare) poate fi selectată și va schimba multe dintre calcule, deși coeficienții de absorbție sunt exacți doar pentru oligonucleotidele monocatenare. Există un număr de modificări 5′ și 3′ care pot fi selectate și vor modifica greutatea moleculară și, în unele cazuri, coeficientul de absorbție pentru oligonucleotidă. Introducerea codurilor IUPAC este, de asemenea, acceptată (de exemplu W pentru A sau T) și are ca rezultat raportarea unui interval de valori pentru temperatura de topire, conținutul %GC, greutatea moleculară, concentrația și microgramele prezente într-o soluție de 1 ml cu un A260 de 1, cu intervalul reprezentând cele mai mari și cele mai mici valori posibile pentru setul de oligonucleotide posibile.

Dacă faceți clic pe butonul „Schimbați șuvițele”, schimbați șuvița introdusă pentru complementul său invers și actualizează proprietățile oligonucleotidei pe baza noii secvențe de șuvițe. Rețineți că, dacă a fost selectat tipul de moleculă „dsDNA” sau „dsRNA”, schimbarea catenelor nu are niciun efect asupra proprietăților generale, deoarece ambele catene sunt deja luate în considerare de calcule.

Dând clic pe „mfold butonul rezultă într-o fereastră nouă care postează în mfold server web ( 1, 2) cu ac de păr probabil și zone auto-complementare evidențiate.

O ultimă opțiune disponibilă este „BLAST”, care deschide o nouă fereastră și postează secvența introdusă pe pagina NCBI BLAST și începe o blastn analiza secvenței introduse față de setul curent de secvențe non-redundante (nr) disponibile la NCBI (3), cu activarea filtrării pentru secvențe de complexitate redusă.

Există, de asemenea, o documentație considerabilă disponibilă, inclusiv o pagină cu modificări chimice, inclusiv denumirile chimice pentru sinonimele comune și linkuri către structurile modificărilor, atunci când sunt disponibile. Această pagină este disponibilă la http://www.basic.northwestern.edu/biotools/OligoCalcModifications.html.


Alte modificări ale capătului 5 & acut / 3 & acut

Mai multe alte modificări, cum ar fi bazele de deoxitimidină inversate și dideoxinucleotidele (Figura 2), au fost raportate pentru a suprima activitatea de nuclează serică atunci când este atașată la capătul oligonucleotidelor sintetice (27). Multe alte modificări pot fi ataşate prin „legători” fie la capătul 5, fie la capătul 3, inclusiv etichete fluorescente, biotină sau alte etichete de afinitate sau grupuri reactive pentru ataşarea la margele sau suprafeţe. Acești linkeri sunt de obicei conectați la capătul 5 & acut sau 3 & acut printr-un fosfodiester. Care este interacțiunea acestor capete modificate cu exonucleazele?

Am analizat o serie de modificări în cadrul tipicului in vitro teste de exonucleaz. În general, în timp ce multe oferă o inhibiție modestă în comparație cu un 5-fosfat, toate exonucleazele testate ar putea scinda toate modificările legate prin legături fosfodiester. Interesant este faptul că această inhibiție slabă a fost valabilă pentru modificările dT inversate, despre care s-a raportat că oferă o stabilitate suplimentară față de degradarea de către exonucleaze serice pentru aptameri și alte oligonucleotide modificate. În mâinile noastre, dT 3 & acut inversat a blocat doar activitatea relativ exonuclează 3 & acută & rarr 5 și acută relativ slabă a ADN polimerazei I, fragment mare (Klenow) (NEB # M0210) și exonuclează T (Exo T, NEB # M0265), dar nu a blocat mai activ exonucleaze cum ar fi în ADN polimeraza T7 (NEB # M0274), Exo I sau Exo III. În mod similar, 5 & d-invers invers acut inhibă parțial numai activitatea Lambda Exo, despre care se știe că necesită un fosfat 5 și acut pentru inițierea eficientă. Alte exonucleaze 5 & acute & rarr 3 & acute nu au fost inhibate semnificativ de această modificare, prezentând digestie completă după o incubare de o oră în condițiile de utilizare recomandate.

Nu recomandăm modificarea finală 5´/3´ ca o strategie bună pentru producerea de nucleotide rezistente la degradarea exonucleazei in vitro. Cercetătorii ar trebui să fie conștienți de faptul că aceste modificări vor fi clivate de majoritatea exonucleazelor, ceea ce ar putea duce la pierderea etichetelor fluorescente și a etichetelor de afinitate. Dacă este necesară o modificare stabilă pentru activitatea de exonuclează, o strategie mai bună este utilizarea etichetelor interne conectate la poziția 5-metil a dT (de exemplu, Fluoresceina dT, Figura 2). Dacă aceste baze dT modificate sunt utilizate aproape de sfârșitul unui oligo, ele pot fi protejate cu legături pt înconjurătoare (Figura 4). Legătura cu baza nu este susceptibilă de clivaj enzimatic, iar legăturile pt vor proteja coloana vertebrală de digestie, așa cum este descris mai sus.

Figura 4: Proiectarea oligonucleotidelor cu modificări rezistente la nuclează


(A) ADN-ul marcat cu fluorescentă finală (FAM) este degradat rapid de exonucleaze. (B) legăturile pt dintre nucleotide împiedică degradarea catenei de ADN, dar eticheta finală poate fi totuși scindată. (C) Un FAMdT intern înconjurat de legături pt va împiedica exonucleaza să scoată eticheta.


Rezumatul diferențelor dintre ADN și ARN

  1. Zahărul pentoză din nucleotida ADN-ului este dezoxiriboză, în timp ce în nucleotida ARN-ului este riboză.
  2. ADN-ul este copiat prin auto-replicare în timp ce ARN-ul este copiat folosind ADN-ul ca plan.
  3. ADN-ul folosește timina ca bază de azot, în timp ce ARN-ul folosește uracil. Diferența dintre timină și uracil este că timina are o grupare metil suplimentară pe al cincilea carbon.
  4. Baza de adenină din ADN se împerechează cu timina, în timp ce baza de adenină din ARN se împerechează cu uracil.
  5. ADN-ul nu-i poate cataliza sinteza, în timp ce ARN-ul poate cataliza sinteza sa.
  6. Structura secundară a ADN-ului constă în principal în dublă helix în formă de B, în timp ce structura secundară a ARN-ului constă din regiuni scurte de formă A a unei elice duble.
  7. Împerecherea bazelor non-Watson-Crick (unde perechea de guanină cu uracil) este permisă în ARN, dar nu și în ADN.
  8. O moleculă de ADN într-o celulă poate avea o lungime de câteva sute de milioane de nucleotide, în timp ce ARN-urile celulare variază în lungime de la mai puțin de o sută la multe mii de nucleotide.
  9. ADN-ul este chimic mult mai stabil decât ARN-ul.
  10. Stabilitatea termică a ADN-ului este mai mică în comparație cu ARN-ul.
  11. ADN-ul este susceptibil la daune ultraviolete, în timp ce ARN-ul este relativ rezistent la acesta.
  12. ADN-ul este prezent în nucleu sau mitocondrii, în timp ce ARN-ul este prezent în citoplasmă.

Noțiuni de bază

ADN-ul și ARN-ul sunt formate din lanțuri lungi de nucleotide care se repetă.

Fiecare nucleotidă este formată din 3 părți:

Un zahăr pentozat

O grupare fosfat

Unul dintre cele patru tipuri de bază de azot

Pentru a forma o catenă, nucleotidele sunt legate în lanțuri, grupele de fosfat și zahăr alternând.


Curba de topire in silico unică: o nouă abordare pentru identificarea polimorfismelor de acid nucleic la Totiviridae

Fundal: Tehnica PCR și variațiile sale au fost din ce în ce mai utilizate în laboratorul clinic și progresele recente în acest domeniu au generat noi tehnici de rezoluție mai mare bazate pe dinamica denaturării acidului nucleic. Principiul acestor noi instrumente moleculare se bazează pe compararea profilurilor de topire, după denaturarea unui ADN dublu catenar. Până în prezent, structura secundară a acizilor nucleici monocatenar nu a fost exploatată pentru a dezvolta sisteme de identificare bazate pe PCR. Pentru a testa potențialul denaturarii ARN monocatenar ca o nouă alternativă pentru a detecta variații specifice de acid nucleic, secvențele de la virusuri din familia Totiviridae au fost comparate folosind o nouă abordare a curbei de topire in silico. Această familie cuprinde virusul ARN dublu catenar, cu un genom constituit din două ORF-uri, ORF1 și ORF2, care codifică proteinele de legare capside/ARN și, respectiv, o ARN polimerază dependentă de ARN (RdRp).

Rezultate: A fost construit un arbore filogenetic bazat pe secvențele de aminoacizi RdRp și au fost definite opt grupe monofiletice. Alinierile secvențelor ARN RdRp din fiecare grup au fost selectate pentru a identifica regiunile ARN cu structură secundară conservată. O regiune din a doua jumătate a ORF2 a fost identificată și modelată individual folosind instrumentul RNAfold. Ulterior, fiecare secvență de ADN sau ARN a fost denaturată in silico utilizând software-urile MELTSIM și ARNheat care generează curbe de topire având în vedere denaturarea unui ADN dublu catenar și, respectiv, a ARN monocatenar. Aceleași grupuri identificate în arborele filogenetic RdRp au fost recuperate printr-o analiză de grupare a datelor curbelor de topire obținute de la RNAheat. Mai mult decât atât, aceeași abordare a fost utilizată pentru a discrimina cu succes diferite variante ale virusului Trichomonas vaginalis, ceea ce nu a fost posibil prin compararea vizuală a curbelor de topire cu dublă catenă generate de MELTSIM.

Concluzie: În analiza silico indică faptul că curbele de topire a ARNs sunt mai informative decât curbele de topire a ADN-ului ADN. Mai mult, structurile de ARN conservate pot fi determinate din analiza indivizilor care sunt filogenetic înrudiți, iar aceste regiuni pot fi utilizate pentru a sprijini reconstituirea grupărilor lor filogenetice. Aceste constatări reprezintă o bază solidă pentru dezvoltarea sistemelor in vitro pentru detectarea curbelor de topire a ARNss.


Progrese recente în modificarea chimică a acizilor nucleici peptidici

Acidul nucleic peptidic (PNA) a devenit un instrument extrem de puternic în chimie și biologie. Deși PNA recunoaște acizi nucleici monocatenar cu afinitate și selectivitate de secvență excepțional de mare, există un efort considerabil în curs de a îmbunătăți în continuare proprietățile PNA atât pentru știința fundamentală, cât și pentru aplicații practice. Lucrarea de față discută studii recente selectate care îmbunătățesc absorbția celulară și legarea PNA la ADN și ARN dublu catenar. Accentul se pune pe modificările chimice ale coloanei vertebrale a PNA și ale nucleobazelor heterociclice. Lucrarea selectează studii recente reprezentative și nu încearcă să ofere o acoperire cuprinzătoare a câmpului larg și vibrant al modificării PNA.

1. Introducere

Acidul nucleic peptidic (PNA) este un analog ADN care are întreaga coloană vertebrală zahăr-fosfodiester înlocuită de o legătură pseudopeptidică construită din resturi de 2-aminoetilglicină (Figura 1) [1]. PNA este foarte stabil din punct de vedere chimic și, din cauza coloanei vertebrale nenaturale, foarte rezistent la degradarea enzimatică, ceea ce îl face un candidat excelent pentru aplicații in vivo ca analog oligonucleotid. Coloana vertebrală pseudopeptidică neutră elimină repulsia electrostatică (un factor care afectează negativ legarea oligonucleotidelor) și PNA se leagă de ADN și ARN cu o afinitate excelentă. PNA se leagă de ADN-ul helicoidal dublu prin două moduri de legare concurente, tripla helix (PNA: ADN, 1: 1) și invazia de catenă, unde PNA deplasează una dintre catenele de ADN, urmată de obicei de o formație triplex (PNA: ADN, 2: 1) [1]. PNA formează, de asemenea, duplexuri Watson-Crick excepțional de puternice și specifice secvenței cu ADN și ARN monocatenar [2]. Interesant, specificitatea secvenței duplexurilor care implică PNA este substanțial mai mare decât cea a acizilor nucleici nemodificați. Datorită acestor calități superioare, PNA a devenit un instrument puternic în biologia chimică și biotehnologie [3-5]. Principalele aplicații ale PNA sunt ca sonde de hibridizare și diagnostice moleculare de afinitate mare și selectivitate pentru ADN monocatenar și ARN. PNA deține, de asemenea, o promisiune de a deveni un nou agent de terapie genică pentru țintirea unor molecule de ARN specifice [3, 4].


Deși PNA leagă ADN monocatenar și ARN cu afinitate și selectivitate superioare, există și alte proprietăți ale PNA care pot fi îmbunătățite în continuare. Cel mai important, aplicațiile in vivo ale PNA nemodificate sunt împiedicate de absorbția celulară slabă și captarea endozomală [6]. Metodele actuale de îmbunătățire a absorbției celulare a PNA, cum ar fi conjugarea cu peptidele cu penetrare celulară (CPP) [7, 8], sunt complicate și necesită concentrații mari de PNA-peptide care pot provoca legarea în afara țintei și toxicitate in vivo. O altă problemă este sfera de acțiune limitată a acizilor nucleici dublu catenari care pot fi recunoscuți de PNA. În timp ce PNA poate lega orice secvență de ADN și ARN monocatenar cu afinitate și selectivitate ridicate, recunoașterea ADN-ului dublu elicoidal a fost limitată la tracturile polipurine și legarea la ARN dublu elicoidal a fost puțin explorată. Prezenta lucrare se concentrează pe cele mai recente evoluții în modificarea chimică a PNA pentru a spori absorbția celulară și recunoașterea acizilor nucleici dubli elicoidali. Mai multe recenzii cuprinzătoare au discutat recent modificarea structurii vertebrale a PNA [9, 10] și a nucleobazelor [11] într-un context mai larg.

2. Conjugarea PNA cu peptide cationice pentru a îmbunătăți absorbția celulară

Trecerea ineficientă a membranei celulare a celulelor de mamifere de către PNA nemodificat a fost o problemă majoră pentru aplicațiile practice in vivo ale PNA. Datorită coloanei vertebrale neutre, PNA nu se asociază cu vehiculele de livrare pe bază de lipide cationice. Pentru a utiliza astfel de transfectanți oligonucleotidici standard precum Lipofectamina, PNA trebuie hibridizat cu oligodeoxinucleotidă complementară (ODN) care ajută la complexarea electrostatică cu lipidele încărcate pozitiv [12]. Recent, o nouă abordare a livrării PNA a fost dezvoltată de Wooley, Taylor și colegii săi [13] care au folosit nanoparticule asemănătoare knedel-ului (cSCK) cu cationică pentru a livra fie hibrid PNA-ODN, fie PNA atașat covalent la nanoparticulele cSCKs printr-o legătură disulfură biodegradabilă. Nanoparticulele cSCK au un miez hidrofob și o înveliș reticulat încărcat pozitiv. Acesta din urmă este extrem de funcționalizabil și mediază livrarea celulară prin, cel mai probabil, un mecanism endocitotic. O extensie elegantă a acestei tehnologii este raportată în acest număr special de Taylor și colegii [14].

Poate că cea mai populară abordare pentru a spori livrarea celulară a fost conjugarea PNA cu peptide care pătrund celule care livrează conjugatul prin calea endocitozei [7, 8]. Cu toate acestea, capacitatea scăzută a conjugaților PNA-CPP de a scăpa de endozomi a fost blocajul acestei abordări. Din păcate, diverși compuși endosomolitici au fost explorați, majoritatea sunt prea toxici pentru aplicații in vivo [7]. Conjugații cu peptide bogate în arginină au demonstrat activitate promițătoare în celulele HeLa în absența agenților endosomolitici [15]. Cu toate acestea, chiar și în cazurile cele mai promițătoare, cantități mari de conjugate au rămas în endozomi, lăsând mult loc pentru îmbunătățiri ulterioare [15]. Concentrațiile relativ ridicate de PNA-CCP, care sunt necesare pentru administrarea eficientă, pot provoca legare în afara țintei și toxicitate in vivo. Mai mult, CPP sunt peptide relativ mari, care complică prepararea și utilizarea conjugatelor PNA-CPP. Recent, mai multe grupuri au demonstrat că modificările cationice relativ simple în PNA pot îmbunătăți substanțial absorbția lor celulară și pot produce un efect similar cu cel al CPP-urilor mai lungi și mai complexe.

Grupurile Corey [16, 17] și Gait [15, 18, 19] au arătat că conjugarea PNA cu oligolizina scurtă (Figura 2, 1 și 2, resp.) a permis livrarea eficientă în fibroblaste și diferite linii de celule canceroase (T47D, MCF-7, Huh7 și HeLa). Doar patru reziduuri de lizină au obținut o eficiență similară cu R6-Penetratin, un CPP optimizat anterior pentru eliberarea celulară de PNA [15]. Utilizarea oligolizinei scurte în loc de CPP mai lung a redus semnificativ complexitatea și efortul necesar pentru utilizarea PNA în cultura celulară. Conjugații lizină au fost de asemenea utilizați pentru a elibera PNA la șoareci [20, 21]. Cel mai recent, Gait și colegii săi au arătat că introducerea unui reziduu terminal Cys a crescut și mai mult absorbția celulară a Cys-Lys-PNA-Lys3 conjugat [22]. În timp ce unele studii au arătat că conjugatele construite din nenatural D-lizina a fost mai eficientă [17], probabil din cauza biostabilității mai mari, alte studii au găsit o diferență mică între L și D seria [22]. Într-un studiu similar, Fabbri și colab. [23] a demonstrat că PNA conjugat la capătul carboxil cu octaarginină a fost preluat eficient în celulele K562 leucemice umane și a inhibat activitatea microRNA-210 țintă.


Nielsen și colegii au raportat recent despre conjugați de PNA cu liganzi cationici care au arătat o livrare și activitate celulară îmbunătățite [24, 25]. Într-un studiu, adăugarea unui domeniu lipidic la peptidele cationice a crescut activitatea conjugatului PNA cu două ordine de mărime [24]. Acidul gras lipofil a contribuit prin promovarea atât a captării endozomale, cât și a scăpării endosomale a PNA. Într-un alt studiu, conjugarea PNA cu polietilenimina a arătat o activitate antisens semnificativ mai mare decât conjugatele PNA-octaarginină [25]. Conjugații de polietilenimină au avut o toxicitate mai mică decât conjugații PNA-octaarginină. Activitatea conjugată a polietileniminei nu a depins de prezența agenților lizozomolitici, ceea ce a sugerat că acești conjugați sunt capabili să scape endosomii în mod eficient. Aceste studii sugerează că abordările chimice pot fi utilizate pentru a adapta modificările cationice care vor îmbunătăți absorbția celulară și vor evita problema captării endosomale.

Conjugarea PNA cu un cation lipofil trifenilfosfoniu sa dovedit a crește livrarea celulară [26, 27]. În acest număr special, Pandey, Patino și colegii [28] raportează despre PNA ciclice și ac de păr conjugate la cationul trifenilfosfoniu printr-o legătură disulfură. Conjugatele inhibă replicarea HIV prin țintirea buclei ARN TAR HIV-1. Cel mai recent, Shiraishi și Nielsen [29] au raportat despre absorbția celulară și activitatea antisens a PNA conjugat cu colesterol și acid colic în celulele HeLa pLuc705. Deși conjugatele singure au fost inactive, livrarea a fost îmbunătățită dramatic prin adăugarea de lipofectamină ducând la activitate antisens nanomolar.

După cum sugerează numeroasele studii recente revizuite mai sus, proiectarea și optimizarea CPP și a altor liganzi cationici pentru eliberarea celulară a PNA este încă un domeniu de cercetare puternic și important. Accentul sa mutat asupra abordării evadării endosomale, îmbunătățind activitatea punctului final și potențialele aplicații in vivo.

3. Modificări ale coloanei vertebrale cationice pentru îmbunătățirea absorbției celulare a PNA

O abordare alternativă la conjugarea PNA a fost modificarea directă a coloanei vertebrale a PNA. Mai multe grupuri au explorat modificările cationice ale PNA [30–32]. Ly și colegii de muncă au introdus grupuri de guanidină la

-poziții [32] ale coloanei vertebrale a PNA prin sinteza personalizată a monomerilor începând de la diaminoetan și L sau D arginină în loc de glicină (Figura 3, L seria prezentată). The

-PNA modificat cu guanidină (GPNA) derivat din nefiresc D-arginina avea o afinitate mai mare pentru ADN-ul complementar [33] și ARN [34] o selectivitate bună a secvenței a fost menținută. GPNA a fost ușor preluat de mai multe linii celulare (HCT116, ES uman și HeLa), care au fost atribuite modificărilor cationice ale guanidinei. GPNA a fost mai puțin toxic pentru celule decât un conjugat PNA-poliarginină și a indus o inhibiție puternică antisens a E-cadherinei în celulele A549 [35]. Laboratorul nostru a studiat recent formarea triplei helix între ARN dublu elicoidal și α-GPNA. Am constatat că α-modificarea guanidinei a scăzut afinitatea de legare a ARN și selectivitatea secvenței α-GPNA în comparație cu PNA nemodificat [36].


The γ-PNA modificat cu guanidină avea o afinitate mai mare pentru ADN și ARN complementar decât α-PNA modificat cu guanidină, probabil din cauza preorganizării favorabile a γ-coloana vertebrală modificată într-o spirală dreaptă [32]. In contrast cu α-PNA modificat, Englund și Appella au constatat că S-izomer al γ-PNA modificat (derivat din natural L-lisină) avea o afinitate mai mare pentru ADN-ul complementar decât R-izomer [30]. Cel mai recent, Manicardi și colab. [37] le-a folosit pe ambele α- și γ-15-meri GPNA modificate pentru a inhiba microARN-210 în celulele K562. Ambii izomeri au prezentat o inhibiție promițătoare, deși nu completă, PNA având opt consecutiv γ-modificarea la capătul carboxil realizând ceva mai bine decât alte modele de modificare [37].

Mitra și Ganesh au raportat rezultate similare privind legarea ADN-ului și absorbția celulară a α- și γ-aminometilen PNA (a.m-PNA, Figura 3) [38, 39]. Modificarea aminometilenului a crescut legarea PNA de ADN, cu γ-(S)a.m-PNA fiind semnificativ mai bun decât α-(R)a.m-PNA, care, la rândul său, a fost mai bun decât α-(S)a.m-PNA [39]. Absorbția celulară a fost îmbunătățită de aceste modificări în aproximativ aceeași ordine, cu γ-(S)a.m-PNA oferind cele mai promițătoare rezultate.

4. Modificări PNA pentru a extinde recunoașterea acizilor nucleici dublu catenar

Recunoașterea ADN-ului și a ARN-ului monocatenar urmând regulile de împerechere a bazelor Watson-Crick este relativ simplă. Recunoașterea acizilor nucleici cu catenă dublă este mult mai dificilă, deoarece fețele Watson-Crick ale nucleobazelor sunt deja angajate în legarea hidrogenului. PNA, precum și alți analogi de oligonucleotide, pot recunoaște acizi nucleici dublu catenar formând fie o triplă helix paralelă (Figura 4(a), capătul amino al PNA aliniat cu capătul 5′ al ADN-ului), fie un complex de invazie a catenei. , unde PNA deplasează una dintre firele de ADN. Invazia șuviței este de obicei un mod concurent pentru triplex (PNA: ADN, 1: 1) și are ca rezultat, de obicei, un triplex cu șuviță (PNA: ADN, 2: 1). Catena PNA care înlocuiește catena ADN se aliniază antiparalel cu catena ADN (Figura 4 (b), capătul carboxil al PNA aliniat cu capătul 5 'al ADN). Ambele moduri de legare sunt limitate la duplexurile cu acid nucleic care prezintă așa-numitele tracturi polipurine în care o catenă este construită din purine, în timp ce cealaltă catenă este formată din pirimidine. Acest lucru se datorează faptului că tripletele Hoogsteen standard (U * A-U și C + * G-C) recunosc doar bazele purinice (Figura 5 (a)).


(A)
(b)
(c)
(A)
(b)
(c)

4.4: Acizi nucleici

Există două tipuri de acizi nucleici în biologie: ADN și ARN. ADN-ul poartă informațiile genetice ereditare ale celulei și este compus din două fire antiparalele de nucleotide dispuse într-o structură elicoidală. Fiecare subunitate de nucleotide este compusă dintr-un zahăr pentoză (dezoxiriboză), o bază azotată și o grupare fosfat. Cele două catene se asociază prin legături de hidrogen între baze azotate complementare chimic. Interacțiunile cunoscute sub numele de interacțiuni de „stivuire de bază” ajută, de asemenea, la stabilizarea dublei helix. Spre deosebire de ADN, ARN-ul poate fi fie monocatenar, fie dublu catenar. De asemenea, este compus dintr-un zahăr pentozic (riboză), o bază azotată și o grupare fosfat. ARN-ul este o moleculă de mai multe trucuri. Este implicat în sinteza proteinelor ca mesager, regulator și catalizator al procesului. ARN-ul este, de asemenea, implicat în diverse alte procese de reglare celulară și ajută la catalizarea unor reacții cheie (mai multe despre aceasta mai târziu). În ceea ce privește ARN, în acest curs ne interesează în primul rând (a) cunoașterea structurii moleculare de bază a ARN-ului și a ceea ce îl deosebește de ADN, (b) înțelegerea chimiei de bază a sintezei ARN care are loc în timpul unui proces numit transcripție, (c ) aprecierea diferitelor roluri pe care ARNA le poate avea în celulă și (d) învățarea tipurilor majore de ARN pe care le veți întâlni cel mai frecvent (adică ARNm, ARNr, ARNt, miARN etc.) și asocierea acestora cu procesele în care sunt implicați cu. În acest modul ne concentrăm în primul rând asupra structurilor chimice ale ADN-ului și ARN-ului și asupra modului în care acestea pot fi distinse unele de altele.

Structura nucleotidelor

Cele două tipuri principale de acizi nucleici sunt acid dezoxiribonucleic (ADN) și acid ribonucleic (ARN). ADN-ul și ARN-ul sunt alcătuite din monomeri cunoscuți sub numele de nucleotide. Nucleotidele individuale se condensează între ele pentru a forma un acid nucleic polimer. Fiecare nucleotidă este alcătuită din trei componente: o bază azotată (pentru care există cinci tipuri diferite), un zahăr pentozat și un grup fosfat. Acestea sunt descrise mai jos. Principala diferență dintre aceste două tipuri de acizi nucleici este prezența sau absența unei grupări hidroxil la C2 poziție, numită și poziția 2 '(citește "două prime"), a pentozei (a se vedea figura 1 legenda și secțiunea despre zahărul pentozei pentru mai multe despre numerotarea carbonului). ARN-ul are o grupare funcțională hidroxil în acea poziție 2’ a zahărului pentoză, zahărul se numește riboză, de unde și numele. riboacid nucleic. Prin contrast, ADN-ului îi lipsește gruparea hidroxil în acea poziție, de unde și numele, „deoxi”. riboacid nucleic. ADN-ul are un atom de hidrogen în poziția 2 '.

figura 1. O nucleotidă este alcătuită din trei componente: o bază azotată, un zahăr pentoză și una sau mai multe grupări fosfat. Carbonii din pentoză sunt numerotați de la 1&prim la 5&prim (primul distinge aceste reziduuri de cele din bază, care sunt numerotate fără a folosi o notație primă). The base is attached to the 1&prime position of the ribose, and the phosphate is attached to the 5&prime position. When a polynucleotide is formed, the 5&prime phosphate of the incoming nucleotide attaches to the 3&prime hydroxyl group at the end of the growing chain. Two types of pentose are found in nucleotides, deoxyribose (found in DNA) and ribose (found in RNA). Deoxyribose is similar in structure to ribose, but it has an -H instead of an -OH at the 2&prime position. Bases can be divided into two categories: purines and pyrimidines. Purines have a double ring structure, and pyrimidines have a single ring.
Atribuire: Marc T. Facciotti (lucrare originală)

The nitrogenous base

The nitrogenous bases of nucleotides are organic molecules and are so named because they contain carbon and nitrogen. They are bases because they contain an amino group that has the potential of binding an extra hydrogen, and thus acting as a base by decreasing the hydrogen ion concentration in the local environment. Each nucleotide in DNA contains one of four possible nitrogenous bases: adenine (A), guanine (G), cytosine (C), and thymine (T). By contrast, RNA contains adenine (A), guanine (G) cytosine (C), and uracil (U) instead of thymine (T).

Adenine and guanine are classified as purine. The primary distinguishing structural feature of a purine is double carbon-nitrogen ring. Cytosine, thymine, and uracil are classified as pyrimidines. These are structurally distinguished by a single carbon-nitrogen ring. You will be expected to recognize that each of these ring structures is decorated by functional groups that may be involved in a variety of chemistries and interactions.

Take a moment to review the nitrogenous bases in Figure 1. Identify functional groups as described in class. For each functional group identified, describe what type of chemistry you expect it to be involved in. Try to identify whether the functional group can act as either a hydrogen bond donor, acceptor, or both?

The pentose sugar

The pentose sugar contains five carbon atoms. Each carbon atom of the sugar molecule are numbered as 1&prime, 2&prime, 3&prime, 4&prime, and 5&prime (1&prime is read as &ldquoone prime&rdquo). The two main functional groups that are attached to the sugar are often named in reference to the carbon to whch they are bound. For example, the phosphate residue is attached to the 5&prime carbon of the sugar and the hydroxyl group is attached to the 3&prime carbon of the sugar. We will often use the carbon number to refer to functional groups on nucleotides so be very familiar with the structure of the pentose sugar.

The pentose sugar in DNA is called deoxyribose, and in RNA, the sugar is ribose. The difference between the sugars is the presence of the hydroxyl group on the 2' carbon of the ribose and its absence on the 2' carbon of the deoxyribose. You can, therefore, determine if you are looking at a DNA or RNA nucleotide by the presence or absence of the hydroxyl group on the 2' carbon atom&mdashyou will likely be asked to do so on numerous occasions, including exams.

The phosphate group

There can be anywhere between one and three phosphate groups bound to the 5' carbon of the sugar. When one phosphate is bound, the nucleotide is referred to as a Nucleotide MonoPhosphate (NMP). If two phosphates are bound the nucleotide is referred to as Nucleotide DeuPhosphate (NDP). When three phosphates are bound to the nucleotide it is referred to as a Nucleotide TriPhosphate (NTP). The phosphoanhydride bonds between that link the phosphate groups to each other have specific chemical properties that make them good for various biological functions. The hydrolysis of the bonds between the phosphate groups is thermodynamically exergonic in biological conditions nature has evolved numerous mechanisms to couple this negative change in free energy to help drive many reactions in the cell. Figure 2 shows the structure of the nucleotide triphosphate Adenosine Triphosphate, ATP, that we will discuss in greater detail in other chapters.

The term "high-energy bond" is used A LOT in biology. This term is, however, a verbal shortcuts that can cause some confusion. The term refers to the amount of negative free energy associated with the hydrolysis of the bond in question. The water (or other equivalent reaction partner) is an important contributor to the energy calculus. In ATP, for instance, simply "breaking" a phosphoanhydride bond - say with imaginary molecular tweezers - by pulling off a phosphate would not be energetically favorable. We must, therefore, be careful not to say that breaking bonds in ATP is energetically favorable or that it "releases energy". Rather, we should be more specific, noting that they hydrolysis of the bond is energetically favorable. Some of this common misconception is tied to, in our opinion, the use of the term "high energy bonds". While in Bis2a we have tried to minimize the use of the vernacular "high energy" when referring to bonds, trying instead to describe biochemical reactions by using more specific terms, as students of biology you will no doubt encounter the potentially misleading - though admittedly useful - short cut "high energy bond" as you continue in your studies. So, keep the above in mind when you are reading or listening to various discussions in biology. Heck, use the term yourself. Just make sure that you really understand what it refers to.

Figura 2. ATP (adenosine triphosphate) has three phosphate groups that can be removed by hydrolysis to form ADP (adenosine diphosphate) or AMP (adenosine monophosphate). Atribuire: Marc T. Facciotti (lucrare originală)

Double helix structure of DNA

DNA has a double helix structure (shown below) created by two strands of covalently linked nucleotide subunits. The sugar and phosphate groups of each strand of nucleotides are positioned on the outside of the helix, forming the backbone of the DNA (highlighted by the orange ribbons in Figure 3). The two strands of the helix run in opposite directions, meaning that the 5&prime carbon end of one strand will face the 3&prime carbon end of its matching strand (See Figures 4 and 5). We referred to this orientation of the two strands as antiparallel. Note too that phosphate groups are depicted in Figure 3 as orange and red "sticks" protruding from the ribbon. The phosphates are negatively charged at physiological pHs and therefore give the backbone of the DNA a strong local negatively charged character. By contrast, the nitrogenous bases are stacked in the interior of the helix (these are depicted as green, blue, red, and white sticks in Figure 3). Pairs of nucleotides interact with one another through specific hydrogen bonds (shown in Figure 5). Each pair of separated from the next base pair in the ladder by 0.34 nm and this close stacking and planar orientation gives rise to energetically favorable base-stacking interactions. The specific chemistry associated with these interactions is beyond the content of Bis2a but is described in more detail here for the curious or more advanced students. We do expect, however, that students are aware that the stacking of the nitrogenous bases contributes to the stability of the double helix and defer to your upper-division genetics and organic chemistry instructors to fill in the chemical details.

Figura 3. Native DNA is an antiparallel double helix. The phosphate backbone (indicated by the curvy lines) is on the outside, and the bases are on the inside. Each base from one strand interacts via hydrogen bonding with a base from the opposing strand. Atribuire: Marc T. Facciotti (lucrare originală)

In a double helix, certain combinations of base pairing are chemically more favored than others based on the types and locations of functional groups on the nitrogenous bases of each nucleotide. In biology we find that:

Adenine (A) is chemically complementary with thymidine (T) (A pairs with T)

Guanine (G) is chemically complementary with cytosine (C) (G pairs with C).

We often refer to this pattern as "base complementarity" and say that the antiparallel strands are complementary to each other. For example, if the sequence of one strand is of DNA is 5'-AATTGGCC-3', the complementary strand would have the sequence 5'-GGCCAATT-3'.

We sometimes choose to represent complementary double-helical structures in text by stacking the complementary strands on top of on another as follows:

5' - GGCCAATTCCATACTAGGT - 3'

3' - CCGGTTAAGGTATGATCCA - 5'

Note that each strand has its 5' and 3' ends labeled and that if one were to walk along each strand starting from the 5' end to the 3' end that the direction of travel would be opposite the other for each strand the strands are antiparallel. We commonly say things like "running 5-prime to 3-prime" or "synthesized 5-prime to 3-prime" to refer to the direction we are reading a sequence or the direction of synthesis. Start getting yourself accustomed to this nomenclature.

Figura 4. Panel A.In a double-stranded DNA molecule, the two strands run antiparallel to one another so that one strand runs 5&prime to 3&prime and the other 3&prime to 5&prime. Here the strands are depicted as blue and green lines pointing in the 5' to 3' orientation. Complementary base pairing is depicted with a horizontal line between complementary bases. Panel B. The two antiparallel strands are depicted in double-helical form. Note that the orientation of the strands is still represented. Moreover, note that the helix is right-handed - the "curl" of the helix, depicted in purple, winds in the direction of the fingers of the hand if the right hand is used and the direction of the helix points towards the thumb. Panel C. This representation shows two structural features that arise from the assembly of the two strands called the major and minor grooves. These grooves can also be seen in Figure 3.
Atribuire: Marc T. Facciotti (lucrare originală)

Figure 5. A zoomed-in molecular-level view of the antiparallel strands in DNA. In a double-stranded DNA molecule, the two strands run antiparallel to one another so that one strand runs 5&prime to 3&prime and the other 3&prime to 5&prime. The phosphate backbone is located on the outside, and the bases are in the middle. Adenine forms hydrogen bonds (or base pairs) with thymine, and guanine base pairs with cytosine.
Atribuire: Marc T. Facciotti (lucrare originală)

Functions and roles of nucleotides and nucleic acids to look out for in Bis2a

In addition to their structural roles in DNA and RNA, nucleotides such as ATP and GTP also serve as mobile energy carriers for the cell. Some students are surprised when they learn to appreciate that the ATP and GTP molecules we discuss in the context of bioenergetics are the same as those involved in the formation of nucleic acids. We will cover this in more detail when we discuss DNA and RNA synthesis reactions. Nucleotides also play important roles as co-factors in many enzymatically catalyzed reactions.

Nucleic acids, RNA in particular, play a variety of roles in in cellular process besides being information storage molecules. Some of the roles that you should keep an eye out for as we progress through the course include: (a) Riboprotein complexes - RNA-Protein complexes in which the RNA serves both catalytic and structural roles. Examples of such complexes include, ribosomes (rRNA), RNases, splicesosome complexes, and telomerase. (b) Information storage and transfer roles. These roles include molecules like DNA, messenger RNA (mRNA), transfer RNA (tRNA). (c) Regulatory roles. Examples of these include various non-coding (ncRNA). Wikipedia has a comprehensive summary of the different types of known RNA molecules that we recommend browsing to get a better sense of the great functional diversity of these molecules.


General characteristics of the viruses

  • The term ‘virus’ is derived from latin which means “slimy poison fluid” or “venom”.
  • The virus is an ultramicroscopic, infectious agent that is metabolically inert so require a living host or cell to multiply. sunt obligate intracellular parasites.
  • Viruși cannot make energy or proteins on their own so these are dependent on their host cell. multiply inside the living cells using host cell machinery.
  • The virus has different strains or types.
  • The virus has its own genetic material either DNA or RNA which may be single or double-stranded.
  • A virus can undergo Mutation.
  • They can be destroyed by Ultraviolet Rays.
  • Acestea sunt not composed of cells. They lack cellular structures such as plasma membrane, nucleus, organelles, etc.
  • They do not respire or perform a gaseous exchange.
  • ei do not move, grow in size but can reproduce by using the metabolism of their hosts.
  • ei can be crystallized and stored in bottles like chemicals.
  • ei lack the enzyme system and do not have the metabolic activity of their own. are not able to survive without a host cell, so active viruses reside inside a host body. They are present either in a bacterial cell, animal cell or plant cell.
  • mărimea: Viruses are much smaller than Bacteria. Their Size ranges from 20 – 1400nm. The poliovirus is 30nm. Giant Mimi viruses are up to 800 nm.
  • Different shapes of Viruses: Viruses are of different shapes. Sunt rod-shaped, bullet-shaped, filament shaped, icosahedral in shape and tadpole-shaped.

Virus structure

Viral Structure: Virus consists of nucleic acid and a protein. Genome or the nucleic acid is covered by a protein coat called the capsid. Some viruses have an envelope outside the capsid. A virus without the envelope is called the Naked virus.


Priveste filmarea: DNA E RNA - ÁCIDOS NUCLEICOS - BIOQUÍMICA. Biologia com Samuel Cunha (Ianuarie 2022).