Informație

12.1: Tăierea și tăierea ARN - Biologie


Pre-ARNr

În E coli, cel rrn operonul este transcris într-un ARN precursor 30S, care conține 3 ARNr și 2 ARNt.

Segmentul care conține ARNr 16S (subunitate ribozomală mică) și cel care conține ARNr 23S (subunitate ribozomală mare) sunt flancați de repetări inversate care formează structura tulpinii în ARN. Tulpinile sunt scindate de RNaza III. Nu există o secvență unică aparentă la care RNaza III se scindează - poate recunoaște o anumită structură a tulpinii. Acest plus evenimentele de clivaj ulterioare (prin o activitate numită M16) generează ARNr 16S și 23S matur. ARNr-urile sunt de asemenea metilate.

ARNt este eliberat de RNazele P și F și ARNr 5S este eliberat de RNazele E și M5

La eucariote

Precursorul inițial este 47S și conține ETS1, ARNr 18S, ITS1, ARNr 5.8S, ITS2 și ARNr 28S, unde ETS = distanțier transcris extragen și ITS = distanțier transcris intragen. Evenimentele specifice de clivaj urmate de metilare generează produsele maturi. De asemenea, unele gene ARNr de la unele specii au introni care trebuie desprinși.

Pre-ARNt în E coli

Scindarea specifică a secvenței de către RNazele P, F, D

  1. RNaza P este o endonuclează care scindează precursorul pentru a genera capătul 5' al ARNt matur.
  2. RNaza F este o endonuclează care scindează nucleotidele precursoare 3 dincolo de capătul 3' al ARNt matur.
  3. RNaza D este o exonuclează care se taie într-o direcție 3' până la 5' pentru a genera capătul 3' sau ARNt matur.

Activitatea catalitică a RNazei P este în componenta ARN

  1. ARNza P este compusă dintr-un ARN de 375 nt și o proteină de 20 kDa.
  2. Activitatea catalitică este în ARN. Se crede că proteina ajută la reacție, dar nu este necesară pentru cataliză. Toate enzimele nu sunt proteine!
  3. Acesta a fost unul dintre primele cazuri descoperite de ARN catalitic, iar Sidney Altman a împărțit Premiul Nobel pentru aceasta.

Enzima ARNt nucleotidil transferazăadaugă CCA la capetele 3' ale pre-ARNt.

  1. Practic, toate ARNt-urile se termină în CCA, formează tulpina acceptoare de amino.
  2. Pentru majoritatea genelor tARN procariote, CCA este codificat la capătul 3’ al genei.
  3. Nicio genă ARNt eucariotă cunoscută nu codifică CCA, ci mai degrabă este adăugată posttranscripțional de către enzima ARNt nucleotidil transferaza. Această enzimă este prezentă într-o mare varietate de organisme, inclusiv bacterii, în acest din urmă caz ​​probabil pentru a adăuga CCA la ARNt-urile deteriorate.

CUT&RUNTools: o conductă flexibilă pentru procesarea CUT&RUN și analiza amprentei

Introducem CUT&RUNTools ca o conductă generală flexibilă pentru facilitarea identificării legăturii proteinelor asociate cromatinei și a analizei amprentei genomice din datele de clivaj primar CUT&RUN vizate de anticorpi. CUT&RUNTools extrage informații despre site-ul tăiat endonucleazei din secvențe de fragmente cu citire scurtă și produce estimări de legare cu un singur loc, amprente de motive agregate și vizualizări informative pentru a sprijini capacitatea de cartografiere de înaltă rezoluție a CUT&RUN. CUT&RUNTools este disponibil la https://bitbucket.org/qzhudfci/cutruntools/.


Introducere

Ultimii ani au fost martorii unei avalanșă de date produse de secvențierea de citire scurtă cu debit mare, numită în mod obișnuit Next Generation Sequencing (NGS). În special, utilizarea citirilor Illumina (cunoscută anterior ca Solexa) este în prezent baza pentru o serie de aplicații biologice, atât în ​​domeniul diagnosticului, cât și al cercetării [1,2]. Acestea includ de novo asamblarea genomilor și transcriptoamelor și alinierea citirilor scurte peste o referință existentă [3,4], detectarea transcriptului himeric [5], inferența haplotipului [6], detectarea metilației [7] etc.

In timp ce de novo asamblarea este folosită în principal pentru a reconstrui orbește un genom sau un transcriptom necunoscut, alinierea de citire are mai multe scopuri: atunci când materialul original este ARNm (ARN-seq), permite măsurarea precisă a nivelurilor transcriptelor și identificarea izoformelor de splicing [8]. În cazul ADN-seq, alinierea citită este fundamentul detectării variantelor, deoarece nepotrivirile sau golurile în aliniere relevă, dacă este susținută de un număr adecvat de citiri, SNP și indeluri scurte [9-12].

Citirile Illumina sunt în mod obișnuit secvențe lungi de 25-250 de nucleotide produse printr-o reacție ciclică de terminație reversibilă asociată cu semnale colorimetrice specifice bazei din mașina de secvențiere. Citirile pot fi separate („lecturi simple”) sau „împerecheate”, caz în care reprezintă ambele extremități ale aceluiași fragment de nucleotide (de obicei 200-1000 bp lungime). Aceste semnale colorimetrice sunt traduse în apeluri de bază printr-un software intern Illumina (CASAVA), reprezentat în formatul FASTQ [13], unde fiecare nucleotidă este asociată unui număr de calitate codificat ASCII corespunzător unui scor PHRED (Q) [14], care este tradus direct în probabilitatea p ca apelul de bază corespunzător să fie incorect prin următoarea ecuație:

Q în rulările recente Illumina variază de la 0 la 41 și, prin urmare, rata de eroare la fiecare poziție variază de la 1 la 0,000079433. Oricare ar fi cauza inițială a nucleotidelor de calitate scăzută/ șansă de eroare ridicată (de exemplu, bule de aer, zgomot de semnal specific punctului, laser/lentil defectuos etc.), valoarea Q este codificată și stocată împreună cu informațiile despre secvență și această informație de încredere. poate fi folosit pentru analiza ulterioară, împreună cu informațiile secvenței în sine.

Ignorarea existenței apelurilor de bază de calitate scăzută poate fi de fapt dăunătoare pentru orice analiză NGS, deoarece poate adăuga secvențe nesigure și potențial aleatorii la setul de date. Aceasta poate constitui o problemă relevantă pentru orice conductă de analiză din aval și poate duce la interpretări false ale datelor. De exemplu, în asamblarea genomului includerea citirilor de calitate scăzută duce la generarea de k-mer falși (subșiruri de citire de dimensiune fixă) [15], care la rândul lor măresc complexitatea procesului de asamblare ulterior [16].

Există două moduri de a trata nucleotidele de calitate scăzută în citirile Illumina. Prima abordare are ca scop corectarea citirilor după suprapunerea lor unele cu altele, în timp ce modelele de frecvență joasă sunt modificate pe baza secvențelor cele mai frecvente, această abordare funcționează de obicei la nivelul k-mers și este adoptată de mai multe instrumente de preprocesare, cum ar fi Quake [17] ] și ALLPATHS-LG [18]. Unele programe de asamblare a genomului pot exclude în mod autonom k-merurile slab suportate din generația contig, de exemplu, ABySS [19] și ALLPATHS-LG [18]. Cu toate acestea, abordarea corecției de citire nu poate fi aplicată oriunde abundența secvenței este intrinsec neuniformă, cum ar fi în transcriptomică (ARN-Seq) [20], metagenomică [21] sau probe heterogene de ADN de cancer [22]. De asemenea, o adâncime redusă de acoperire face ca strategiile de corectare a citirii să nu fie fezabile, Quake necesitând cel puțin 15x [17] și ALLPATHS-LG sugerând 100x ca acoperire optimă [18].

A doua abordare pentru a trata nucleotidele de calitate scăzută nu vizează modificarea setului de date citit inițial, ci mai degrabă eliminarea bazelor de calitate scăzută, încercând să elimine chirurgical doar regiunile de calitate scăzută într-o procedură cunoscută sub denumirea de „tuiere” citită. Acest pas de preprocesare este un proces non-trivial, abordat în moduri diferite de diferiți algoritmi, implementări și instrumente, dintre care majoritatea sunt colectate și descrise în această lucrare (Tabelul 1). Principiul de bază al tăierii citirii este de a opera o estimare educată a ratelor de eroare de citire, încercând să păstreze cea mai lungă secvență de înaltă calitate posibilă.

InstrumentVersiuneLegăturăLimbaFamilia de algoritmiPoate lucra direct pe gzipPoate lucra la capătul perecheAutodetecție în format PHREDFuncționează la ambele capete de cititNote
Cutadapt1.1code.google.com/p/cutadapt/downloads/listPython și CSumă curentădaNuNuNuSe pot scoate și adaptoarele, cu mai multe filete
ConDeTri2.2code.google.com/p/condetri/PerlPe fereastrăda (din v2.2)daNuNu
ERNE-FILTER1.2sourceforge.net/projects/erne/files/C++Sumă curentădadadadaPoate fi combinat cu eliminarea contaminanților, cu mai multe fire
Trimmer de calitate FASTX0.0.13.2hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/download.htmlC++Pe fereastrăNuNuNuNuParametrul implicit pentru lungimea minimă de citire (-p) este setat la zero
PRINSEQ0:19:05sourceforge.net/projects/prinseq/files/PerlPe fereastrăNuNuNudaDe asemenea, interfață web pentru date de dimensiune medie
Trimomatic0.22www.usadellab.org/cms/index.php?page=trimmomaticJavaPe fereastrădadaNudaSe pot scoate și adaptoarele
SolexaQA1.13sourceforge.net/projects/solexaqa/files/PerlPe fereastră (suma curentă cu opțiunea -bwa)NuNudaNuNu se poate specifica lungimea minimă de citire de păstrat
Secera1.2github.com/ucdavis-bioinformatics/sickleCPe fereastrădadaNuda

Tabelul 1. Disponibilitatea și caracteristicile sculelor de tundere investigate în lucrarea curentă.

Tăierea a fost adoptată pe scară largă în cele mai recente studii NGS, în special înainte de asamblarea genomului [23], asamblarea transcriptomului [24], reconstrucția metagenomului [25], ARN-Seq [26,27], studiile epigenetice [7] și genomica comparativă [25] 28]. În ciuda popularității sale, până acum nu a fost realizată nici o evaluare cuprinzătoare a efectelor de tăiere asupra analizelor NGS obișnuite, nici o comparație amplă a instrumentelor existente. Mai multe metode au fost descrise individual în literatură [16,29,30], dar utilitatea lor a fost dovedită numai în cazuri particulare de asamblare a genomului.

În lucrarea de față, descriem metodele existente pentru tăierea citirii Illlumina, introducând în același timp o nouă implementare optimizată a algoritmului de tăiere al lui Mott [14]. Vom evalua performanțele acestor metode la diferite praguri Q în trei domenii fundamentale ale investigației NGS: de novo asamblarea genomului, maparea ARN și genotiparea (în special, identificarea SNP), folosind două seturi de date disponibile public pentru fiecare categorie. Arătăm modul în care interpretarea biologică a datelor poate fi influențată în mare măsură de (lipsa) adoptării anumitor combinații de metode de tăiere/prag. Mai mult, decuparea citirii afectează foarte mult utilizarea resurselor reducând timpul de calcul și costurile asociate. Lucrarea curentă nu se va concentra asupra altor metode de preprocesare a citirii Illumina aplicate în mod obișnuit, și anume corectarea citirii deja citate [17], îndepărtarea dublelor [31], filtrarea secvenței contaminanților [30] sau îndepărtarea adaptorului [32].


Scripturile Python personalizate utilizate pentru analizele de date NGS descrise sunt disponibile online prin GitHub (https://github.com/sternberglab/Vo_etal_2020). Instrumentul de proiectare ARN ghid INTEGRATE și documentația asociată sunt disponibile online prin GitHub (https://github.com/sternberglab/INTEGRATE-guide-RNA-tool).

Dunbar, C. E. şi colab. Terapia genică ajunge la majoritate. Ştiinţă 359, eaan4672 (2018).

Gelvin, S. B. Integrarea Agrobacterium ADN-T în genomul plantei. Annu. Pr. Genet. 51, 195–217 (2017).

Davy, A. M., Kildegaard, H. F. & Andersen, M. R. Ingineria fabricii de celule. Cell Syst. 4, 262–275 (2017).

Brophy, J. A. N. şi colab. Elemente integrative și conjugative concepute pentru un transfer eficient și inductibil de ADN către bacteriile nedomesticate. Nat. Microbiol. 3, 1043–1053 (2018).

Miyazaki, R. & amp van der Meer, J. R. Un nou sistem de livrare a unui fragment mare de ADN bazat pe activitatea integrazei dintr-un element integrativ și conjugativ. Aplic. Mediul. Microbiol. 79, 4440–4447 (2013).

Martínez-García, E. & amp de Lorenzo, V. Instrumente genetice bazate pe transpozon și plasmide pentru editarea genomilor bacteriilor gram-negative. Metode Mol. Biol. 813, 267–283 (2012).

van Opijnen, T., Bodi, K. L. & amp Camilli, A. Tn-seq: secvențiere paralelă de mare debit pentru studii de fitness și interacțiune genetică în microorganisme. Nat. Metode 6, 767–772 (2009).

Wang, H. H. şi colab. Ingineria promotorului la scară genomică prin selecție MAGE. Nat. Metode 9, 591–593 (2012).

Sharan, S. K., Thomason, L. C., Kuznetsov, S. G. & Court, D. L. Recombineering: o metodă de inginerie genetică bazată pe recombinare omoloagă. Nat. Protoc. 4, 206–223 (2009).

Zhang, Y., Buchholz, F., Muyrers, J. P. & amp Stewart, A. F. O nouă logică pentru ingineria ADN-ului folosind recombinarea în Escherichia coli. Nat. Genet. 20, 123–128 (1998).

Baba, T. şi colab. Construcție de Escherichia coli K-12 în cadru, mutanți knockout cu o singură genă: colecția Keio. Mol. Syst. Biol. 2, 2006.0008 (2006).

Cotta-de-Almeida, V., Schonhoff, S., Shibata, T., Leiter, A. & Snapper, S. B. O nouă metodă pentru generarea rapidă a vectorilor de direcționare a genelor prin inginerie BAC prin recombinare omoloagă în bacterii. Genom Res. 13, 2190–2194 (2003).

Datsenko, K. A. & amp Wanner, B. L. Inactivarea într-un singur pas a genelor cromozomiale în Escherichia coli K-12 folosind produse PCR. Proc. Natl Acad. Sci. Statele Unite ale Americii 97, 6640–6645 (2000).

Jiang, W., Bikard, D., Cox, D., Zhang, F. & Marraffini, L. A. Editarea ghidată de ARN a genomurilor bacteriene folosind sistemele CRISPR-Cas. Nat. Biotehnologia. 31, 233–239 (2013).

Wang, K. şi colab. Definirea schemelor de compresie a codonilor sinonimi prin recodarea genomului. Natură 539, 59–64 (2016).

Sukhija, K. și colab. Dezvoltarea unei abordări extinse de inginerie genomică bazată pe recombinare pentru a introduce gene heterologe la Escherichia coli genomului. Mol. Biotehnologia. 51, 109–118 (2012).

Wang, H. H. şi colab. Programarea celulelor prin inginerie genomului multiplex și evoluție accelerată. Natură 460, 894–898 (2009).

Vento, J. M., Crook, N. & amp Beisel, C. L. Bariere la editarea genomului cu CRISPR în bacterii. J. Ind. Microbiol. Biotehnologia. 46, 1327–1341 (2019).

Jiang, Y. şi colab. Editarea genomului asistată CRISPR-Cpf1 Corynebacterium glutamicum. Nat. comun. 8, 15179 (2017).

Kosicki, M., Tomberg, K. & amp Bradley, A. Repararea rupurilor duble catenelor induse de CRISPR–Cas9 duce la ștergeri mari și rearanjamente complexe. Nat. Biotehnologia. 36, 765–771 (2018).

Wannier, T. M. şi colab. Recombinarea bacteriană îmbunătățită prin descoperirea proteinelor paralelizate. Proc. Natl Acad. Sci. Statele Unite ale Americii 117, 13689–13698 (2020).

Corts, A. D., Thomason, L. C., Gill, R. T. și Gralnick, J. A. Un nou sistem de recombinare pentru editarea precisă a genomului în tulpina Shewanella oneidensis MR-1 folosind oligonucleotide monocatenar. Sci. Reprezentant. 9, 39 (2019).

Peters, J. M. şi colab. Permiterea analizei genetice a diverselor bacterii cu Mobile-CRISPRi. Nat. Microbiol. 4, 244–250 (2019).

St-Pierre, F. şi colab. Clonarea într-un singur pas și integrarea cromozomială a ADN-ului. ACS Synth. Biol. 2, 537–541 (2013).

Tellier, M., Bouuaert, C. C. & Chalmers, R. Mariner și superfamilia ITm a transpozonilor. Microbiol. Spectr. 3, MDNA3–0033–2014 (2015).

van Opijnen, T. & Camilli, A. Transposon insertion sequencing: un nou instrument pentru analiza la nivel de sisteme a microorganismelor. Nat. Rev. Microbiol. 11, 435–442 (2013).

Haniford, D. B. și Ellis, M. J. Transposons Tn10 și Tn5. Microbiol. Spectr. 3, MDNA3–0002–2014 (2015).

Goodall, E. C. A. și colab. Genomul esențial al Escherichia coli K-12. Mbio 9, e02096-17 (2018).

Chen, S. P. & amp Wang, H. H. Un sistem Cas-transposon proiectat pentru transpoziții ADN programabile și direcționate pe site. CRISPR J. 2, 376–394 (2019).

Bhatt, S. & amp Chalmers, R. Transpunerea ADN țintită in vitro utilizând o proteină de fuziune a transpozazei dCas9. Acizi nucleici Res. 6, 7–10 (2019).

Enyeart, P. J., Mohr, G., Ellington, A. D. și Lambowitz, A. M. Aplicații biotehnologice ale intronilor mobili din grupul II și transcriptazele lor inverse: țintirea genelor, ARN-seq și analiză ARN necodant. Gloată. ADN 5, 2 (2014).

Esvelt, K. M. și Wang, H. H. Inginerie la scară genomică pentru sisteme și biologie sintetică. Mol. Syst. Biol. 9, 641 (2013).

Perutka, J., Wang, W., Goerlitz, D. și Lambowitz, A. M. Utilizarea intronilor grupului II proiectați pe computer pentru a perturba Escherichia coli Proteina DExH/D-box și genele ADN helicaza. J. Mol. Biol. 336, 421–439 (2004).

Karberg, M. şi colab. Intronii de grup II ca vectori controlabili de țintire a genei pentru manipularea genetică a bacteriilor. Nat. Biotehnologia. 19, 1162–1167 (2001).

Klompe, S. E., Vo, P. L. H., Halpin-Healy, T. S. & amp Sternberg, S. H. Sistemele CRISPR-Cas codificate cu transpozon direcționează integrarea ADN-ului ghidată de ARN. Natură 571, 219–225 (2019).

Peters, J. E., Makarova, K. S., Shmakov, S. & amp Koonin, E. V. Recrutarea sistemelor CRISPR–Cas de către transpozoni de tip Tn7. Proc. Natl Acad. Sci. Statele Unite ale Americii 114, E7358–E7366 (2017).

Halpin-Healy, T. S., Klompe, S. E., Sternberg, S. H. & amp Fernández, I. S. Baza structurală a țintirii ADN-ului printr-un sistem CRISPR-Cas codificat cu transpozon. Natură 577, 271–274 (2020).

Faure, G. şi colab. CRISPR-Cas în elemente genetice mobile: contra-apărare și nu numai. Nat. Rev. Microbiol. 17, 513–525 (2019).

Peters, J. E. Transpunere vizată cu elemente Tn7: site-uri sigure, plasmide mobile, CRISPR/Cas și nu numai. Mol. Microbiol. 112, 1635–1644 (2019).

Strecker, J. şi colab. Inserție de ADN ghidată de ARN cu transpozaze asociate CRISPR. Ştiinţă 365, 48–53 (2019).

Chavez, M. & amp Qi, L. S. Transpunere programabilă pe site: schimbarea paradigmei pentru sistemele CRISPR–Cas. Mol. Celulă. 75, 206–208 (2019).

Hou, Z. & amp Zhang, Y. Inserting DNA with CRISPR. Ştiinţă 365, 25–26 (2019).

Ronda, C., Chen, S. P., Cabral, V., Yaung, S. J. și Wang, H. H. Ingineria metagenomică a microbiomului intestinal de mamifere in situ. Nat Meth 16, 167–170 (2019).

Stellwagen, A. E. & amp Craig, N. L. Evitarea de sine: două proteine ​​codificate Tn7 mediază imunitatea țintă în transpunerea Tn7. EMBO J. 16, 6823–6834 (1997).

Greene, E. C. și Mizuuchi, K. Target immunity during Mu DNA transposition. Asamblarea transpozozomului și bucla ADN-ului îmbunătățesc dezasamblarea mediată de MuA a complexului țintă MuB. Mol. Celulă 10, 1367–1378 (2002).

Transpunerea Hagemann, A. T. & amp Craig, N. L. Tn7 creează un punct fierbinte pentru recombinarea omoloagă la locul donor de transpozon. Genetica 133, 9–16 (1993).

Lin, M. T. şi colab. În Metode în Enzimologie Etichetarea izotopilor a biomoleculelor - Metode de etichetare Vol. 565 (Ed. Kelman, Z.) 45–66 (Academic Press, 2015).

Hickman, A. B. & Dyda, F. Transpunerea ADN-ului la locul de muncă. Chim. Rev. 116, 12758–12784 (2016).

Abbas, A. F., Al-Saadi, A. G. M. & Alkhudhairy, M. K. Formarea biofilmului și determinanții de virulență ai Klebsiella oxytoca izolate clinice de la pacienții cu cancer colorectal. J. Gastrointest. Cancer 51, 855–860 (2019).

Kim, D.-K. et al. Ingineria metabolică a unui roman Klebsiella oxytoca tulpină pentru producția îmbunătățită de 2,3-butandiol. J. Biosci. Bioing. 116, 186–192 (2013).

Loeschcke, A. și Thies, S. Pseudomonas putida—o gazdă versatilă pentru producția de produse naturale. Aplic. Microbiol. Biotehnologia. 99, 6197–6214 (2015).

Nikel, P. I. & de Lorenzo, V. Pseudomonas putida ca șasiu funcțional pentru biocataliza industrială: de la biochimia nativă la trans-metabolism. Metab. ing. 50, 142–155 (2018).

Sun, J. şi colab. Editarea genomului și reprimarea transcripțională în Pseudomonas putida KT2440 prin sistemul CRISPR de tip II. Microb. Faptul celular. 17, 41 (2018).

Wirth, N. T., Kozaeva, E. & Nikel, P. I. Accelerated genome engineering of Pseudomonas putida prin recombinare mediată de I-SceI și contraselectare CRISPR-Cas9. Microb. Biotehnologia. 13, 233–249 (2020).

Tsai, S. Q. & amp Joung, J. K. Definirea și îmbunătățirea specificităților la nivel de genom ale nucleazelor CRISPR-Cas9. Nat. Pr. Genet. 17, 300–312 (2016).

Zhang, Y. şi colab. Integrare cromozomială multicopie folosind transpozaze asociate CRISPR. ACS Synth. Biol. 9, 1998–2008 (2020).

Yu, B. J. și Kim, C. Minimizarea genomului Escherichia coli folosind sistemul de excizie Cre/loxP țintit Tn5. Nat. Biotehnologia. 20, 1018–1023 (2008).

Adiego-Pérez, B. și colab. Editarea genomului multiplex al microorganismelor folosind CRISPR-Cas. FEMS Microbiol. Lett. 366, fnz086 (2019).

Horlbeck, M. A. și colab. Cartografierea peisajului genetic al celulelor umane. Celulă 174, 953–967(2018).

Bassalo, M. C. şi colab. Integrarea rapidă și eficientă a căii metabolice într-un singur pas în E coli. ACS Synth. Biol. 5, 561–568 (2016).

Rubin, B. E. şi colab. Editarea țintită a genomului bacteriilor în cadrul comunităților microbiene. Pretipărire la bioRxiv https://doi.org/10.1101/2020.07.17.209189 (2020).

Valderrama, J. A., Kulkarni, S. S., Nizet, V. & Bier, E. Un sistem de antrenare a genelor bacteriene editează și inactivează eficient un locus de rezistență la antibiotice cu număr mare de copii. Nat. comun. 10, 5726–5728 (2019).

Duque, E. şi colab. Identificarea și elucidarea funcției in vivo a două alanin racemaze din Pseudomonas putida KT2440. Mediul. Microbiol. Reprezentant. 9, 581–588 (2017).

Aparicio, T., de Lorenzo, V. & amp Martínez-García, E. CRISPR/Cas9-enhanced ssDNA recombineering for Pseudomonas putida. Microb. Biotehnologia. 12, 1076–1089 (2019).

Langmead, B. & Salzberg, S. L. Aliniere rapidă cu citire întreruptă cu Bowtie 2. Nat. Metode 9, 357–359 (2012).

Rice, P. A., Craig, N. L. & Dyda, F. Comentariu despre „inserția ADN-ului ghidată de ARN cu transpozaze asociate CRISPR”. Ştiinţă 368, eabb2022 (2020).

Strecker, J., Ladha, A., Makarova, K. S., Koonin, E. V. & amp Zhang, F. Răspuns la comentariul privind „inserția ADN-ului ghidată de ARN cu transpozaze asociate CRISPR”. Ştiinţă 368, eabb2920 (2020).

Kozich, J. J., Westcott, S. L., Baxter, N. T., Highlander, S. K. & amp Schloss, P. D. Dezvoltarea unei strategii de secvențiere cu index dublu și a unei conducte de curare pentru analiza datelor secvențelor de ampliconi pe platforma de secvențiere MiSeq Illumina. Aplic. Mediul. Microbiol. 79, 5112–5120 (2013).

Callahan, B. J. şi colab. DADA2: inferență de probă de înaltă rezoluție din datele ampliconului Illumina. Nat. Metode 13, 581–583 (2016).

McMurdie, P. J. și Holmes, S. phyloseq: un pachet R pentru analiza interactivă reproductibilă și grafică a datelor recensământului microbiomului. Plus unu 8, e61217 (2013).


Biologie sintetică a ARN

Moleculele de ARN joacă roluri de reglare importante și diverse în celulă, în virtutea interacțiunii lor cu alți acizi nucleici, proteine ​​și molecule mici. Inspirați de această versatilitate naturală, cercetătorii au conceput molecule de ARN cu noi funcții biologice. În ultimii doi ani, eforturile în biologia sintetică au produs noi componente ARN sintetice capabile să regleze expresia genelor in vivo în mare parte în bacterii și drojdii, creând scena pentru un comportament celular scalabil și programabil. Provocările imediate pentru acest domeniu în curs de dezvoltare includ determinarea modului în care tehnicile computaționale și de evoluție direcționată pot fi implementate pentru a crește complexitatea sistemelor de ARN proiectate, precum și determinarea modului în care astfel de sisteme pot fi extinse pe scară largă la sistemele de mamifere. Alte provocări includ proiectarea moleculelor de ARN pentru a fi senzori de stimuli intracelulari și de mediu, sonde pentru a explora comportamentul rețelelor biologice și componente ale sistemelor de control celular proiectate.


30 septembrie-oct. 2, 2020 | 10:00 EDT | 14:00 UTC*
*Programul este în curs de dezvoltare și poate fi modificat

Atenţie

Partea live a acestei conferințe s-a încheiat și toate prezentările sunt acum disponibile pentru cumpărare la cerere. Înregistrările la evenimentul live pot accesa acest conținut oricând, timp de până la 9 luni de la eveniment.

Acces gratuit la conținut la cerere pentru oamenii de știință din țările cu venituri mici și medii

Keystone Symposia salută comunitatea științifică globală și își propune să conecteze cercetătorii din cadrul și din cadrul disciplinelor pentru a accelera progresul științelor biomedicale și ale vieții. Acest formular poate fi folosit pentru oamenii de știință din țările cu venituri mici și medii din toate etapele carierei pentru a determina eligibilitatea și pentru a solicita acces gratuit la conținutul științific prezentat în timpul evenimentelor recente eSymposia. Dacă sunteți eligibil, vi se va trimite un cod de acces pentru conținutul la cerere al evenimentului (eSymposia) de interes.

Modificările biochimice aduse ARN-ului după transcripție, numite epitranscriptom, joacă un rol critic în viață. Dezvoltarea noilor tehnologii a transformat domeniul în ultimii ani. Înțelegerea noastră a motivului și a reglementării editării și modificărilor ARN, precum și a rolurilor acestora în infecțiile și bolile umane se aprofundează și apar aplicații terapeutice. Această conferință virtuală va reuni experți de top în editarea și modificările ARN, dezvoltarea tehnologiei și medicină pentru a prezenta și discuta cercetările de ultimă oră. Anticipăm că participanții la această conferință vor beneficia de pe urma cunoașterii de vârf a domeniului care avansează rapid și vor ajuta să avanseze domeniul prin crearea de oportunități de colaborare.

Programul este destinat cercetătorilor științifici și publicului clinic.

Alăturați-vă nouă pentru acest eveniment virtual emblematic, oferit de Keystone Symposia.

Preț:

Rata obișnuită de înregistrare: 275 USD
Rata de înregistrare a studenților: 150 USD

Termenele limită:

Burse: A trecut
Trimitere rezumate: A trecut


O vedere mai clară a enzimei de tăiere a ADN-ului

Oamenii de știință de la Institutul Medical Howard Hughes (HHMI) au creat un portret al unei proteine ​​de tăiere a ADN-ului numită Cas9, un instrument puternic de cercetare folosit în multe laboratoare pentru editarea genomului.

Oamenii de știință de la Institutul Medical Howard Hughes (HHMI) au creat un portret al unei proteine ​​de tăiere a ADN-ului numită Cas9, care dezvăluie modul în care enzima se remodelează atunci când se asociază cu o moleculă de ARN, creând un canal care îi permite să găsească și să-și scindeze ținta ADN-ului. Complexul proteină-ARN este o componentă cheie a unui sistem imunitar bacterian primitiv numit CRISPR și este, de asemenea, folosit de cercetători pentru a tăia secvențe specifice de ADN în laborator pentru aplicații de editare a genomului.

„Aceste proteine ​​au avut un succes extraordinar în a induce modificări genetice specifice locului în aproape fiecare sistem în care au fost încercate”, spune investigatorul HHMI Jennifer A. Doudna, unul dintre liderii studiului. Noua înțelegere a transformărilor structurale pe care Cas9 le suferă atunci când întâlnește pentru prima dată un ghid ARN și mai târziu, ADN și mdash ajută la explicarea modului în care funcționează enzima și oferă o perspectivă asupra modului în care cercetătorii îi pot controla activitatea, spune ea.

Doudna, care este la Universitatea din California, Berkeley, a condus analizele structurale și biochimice ale Cas9 împreună cu investigatorul HHMI Eva Nogales la Laboratorul Național Lawrence Berkeley și Emmanuelle Charpentier la Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung GmbH din Germania. Lucrarea lor a fost publicată pe 7 februarie 2014 în jurnal Ştiinţă.

Multe bacterii au un sistem imunitar bazat pe CRISPR care este folosit pentru a recunoaște și distruge genomul virusurilor și plasmidelor invadatoare. În 2012, laboratoarele Doudna și Charpentier au arătat că Cas9 este o enzimă de tăiere a ADN-ului ghidată de ARN. Cas9 se bazează pe două secvențe scurte de ghidare de ARN pentru a găsi ADN străin, apoi scindează secvențele țintă, reducând astfel la tăcere genele invadatorilor.

Procesul este suficient de specific și eficient pentru a preveni infecțiile virale la bacterii, iar aceleași calități au făcut din sistemul CRISPR un instrument puternic de cercetare. Echipa lui Doudna a adaptat sistemul astfel încât să poată fi ghidat de o singură moleculă scurtă de ARN. Cercetătorii care folosesc sistemul pentru editarea genomului pot personaliza acel ARN, astfel încât să direcționeze Cas9 să se scindeze într-o locație dorită din genom.

Pentru studiul actual, Doudna, Nogales și Charpentier au făcut echipă pentru a vedea mai îndeaproape enzima. „Suntem foarte dornici să înțelegem cum această enzimă este capabilă să recunoască ADN-ul la fel de specific cum o face și ce îi controlează activitatea în celule”, spune Doudna. Echipa a ales să analizeze două versiuni de Cas9, luate de la diferite specii de bacterii. O proteină este cu aproximativ 25 la sută mai mare decât cealaltă, dar ambele scindează țintele ADN așa cum este direcționat de ARN.

Martin Jinek, un specialist în cercetare HHMI în laboratorul lui Doudna, care acum își conduce propriul laborator la Universitatea din Zurich, și Fuguo Jiang, un cercetător postdoctoral în laboratorul lui Doudna, au folosit cristalografia cu raze X pentru a determina structura atomică detaliată a fiecăruia. dintre cele două proteine ​​Cas9. Cea mai utilizată metodă pentru determinarea structurii este cristalografia cu raze X. În această tehnică, proteinele cristalizate sunt mai întâi bombardate cu fascicule de raze X. Pe măsură ce razele X revin de atomii din cristal, ele lasă un model de difracție, care poate fi apoi analizat pentru a determina forma tridimensională a proteinei.

Când au studiat structura Cas9, cercetătorii au descoperit că era format din doi lobi, cu regiunile de scindare a ADN-ului grupându-se într-un singur lob. Regiunile variabile ale proteinelor se încadrau în cel de-al doilea lob, ceea ce a explicat diferențele lor de dimensiune. Sunt necesare experimente suplimentare pentru a testa modul în care variațiile din al doilea lob afectează funcția proteinelor, dar Doudna spune că descoperirile sunt încurajatoare pentru aplicațiile de editare a genomului.

„Mulți oameni sunt interesați dacă această enzimă Cas9 poate fi proiectată pentru a fi chiar mai mică decât oricare dintre variantele naturale”, spune ea, explicând că unii dintre vectorii folosiți pentru a introduce Cas9 în celule tolerează doar inserții mici. &ldquoPe baza comparării acestor două structuri, credem că evoluția a făcut deja acest lucru: este deja mestecat la un lob al proteinei, care este departe de locul în care se află situsurile catalitice. De asemenea, credem că ar putea fi posibil să facem și mai multe tăieturi și să generăm o proteină care păstrează toată funcționalitatea Cas9, dar este într-o stare mai eficientă.&rdquo

Studiile de cristalografie cu raze X au oferit cercetătorilor o vedere detaliată numai a proteinei Cas9. Dar au fost, de asemenea, curioși cum a interacționat enzima globulară cu ARN și ADN pentru a-și găsi ținta.

Ei au ales să vizualizeze Cas9 folosind microscopia electronică, o tehnică care poate oferi la fel de multe detalii structurale ca cristalografia cu raze X, dar permite și cercetătorilor să se uite la proteinele în soluție, în care acestea pot interacționa în mod natural cu alte molecule. Samuel Sternberg, un student absolvent în laboratorul lui Doudna, și David Taylor, un cercetător postdoctoral comun în laboratoarele lui Nogales și Doudna, au folosit microscopia electronică pentru a captura imagini cu Cas9 singur, apoi în asociere cu o moleculă ghid de ARN și, în final, au interacționat cu ADN.

Ceea ce au descoperit, explică Nogales, este că atunci când Cas9 se asociază cu ARN, acesta se reconfigurează, formând un canal în centrul proteinei și pregătindu-se, se pare, să interacționeze cu ADN-ul. Într-adevăr, atunci când complexului Cas9-ARN a fost lăsat să interacționeze cu ADN-ul, cercetătorii au văzut vârfuri ale moleculei de ADN la care au atașat etichete de proteine ​​pentru vizualizare și ieșind din capetele canalului. Cu experimente biochimice suplimentare, ei au arătat, de asemenea, modul în care buclele din proteina Cas9 contribuie la recunoașterea ADN-ului, permițând lui Cas9 să interacționeze în mod specific cu mici motive ADN despre care Doudna și colegii au arătat recent că îi permit lui Cas9 să înceapă scanarea în căutarea secvenței sale țintă.

Împreună, aceste descoperiri oferă o imagine cuprinzătoare a structurii lui Cas9 și a modificărilor conformaționale în timpul asamblării complexe, spun oamenii de știință. „În mod neașteptat, ARN-ul ghid, despre care se credea că servește practic drept șablon pentru a determina ce ADN va fi scindat, este cel mai probabil necesar pentru a activa proteina prin schimbarea conformației”, spune Nogales. Cercetătorii vor trebui să țină cont de această funcție dacă intenționează să simplifice sistemul CRISPR pentru aplicații de biotehnologie, adaugă ea. &ldquoAceasta este o cerință minimă care nu poate fi uitată.&rdquo


Priveste filmarea: DNA transcription and translation McGraw Hill (Ianuarie 2022).