Informație

Conținutul de ADN din semințele plantelor față de carnea fructelor

Conținutul de ADN din semințele plantelor față de carnea fructelor


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Există o publicație care compară randamentul ADN și/sau amplificabilitatea PCR după extracția din pulpa de fructe (cum ar fi mere, portocale, cireșe etc.) în comparație cu semințele acelorași fructe?

Aș prefera o referință, dar experiența ta nepublicată este și ea interesantă pentru mine.


Depinde de sămânța și fructul despre care vorbești.

Cantitatea de ADN din proba ta de materie vegetală zdrobită depinde doar de un singur lucru - câte celule sunt în proba ta. Priviți această diagramă a unui sâmbure de porumb (U din Indiana):

Există diferite densități celulare în fiecare zonă - în endosperm, celulele pot fi uriașe (și, prin urmare, au o densitate mai mică a ADN-ului în comparație cu embrionul).

Să ne uităm la o sămânță de muștar pătată (U of London):

După cum puteți vedea, celulele de aici sunt foarte dense. Mai dens înseamnă mai mult ADN per unitate de probă.

În ceea ce privește fructele, se aplică aceeași regulă de bază. Verner, 1938 arată o histologie grozavă a țesutului de măr care vă poate oferi o idee despre densitatea celulară în țesutul fructului (din nou, va fi diferită în diferite fructe - căutați"histologie nume de fructe"daca esti interesat).

Cu toate acestea, acum că am vorbit despre densitate, trebuie să ne gândim efectiv la scoaterea ADN-ului. Procesul de extracție este de fapt mult mai important în ceea ce privește randamentul final.

Multe semințe de plante conțin polifenolici, care pot provoca degradarea ADN-ului. Acest protocol (Cornell U) detaliază multe dintre posibilele deficiențe:

S-a raportat, de asemenea, că acești compuși cauzează dificultăți în purificarea ADN-ului la alte specii de plante; polizaharide (Murray şi Thompson, 1980; Fang şi colab., 1992); compuși polifenolici (Katterman și Shattuck, 1983; Couch și Fritz, 1990; Howland și colab. 1991; Collins și Symons, 1992); și materiale lipicioase și rășinoase (Webb și Knapp, 1990).

Acești contaminanți pot degrada ADN-ul, dar îl pot face și inutilizabil în amplificarea PCR și digestia endonucleazei (Kim et al. 1997, Cornell U, EPICENTER Biotechnologies).

În general, există cu siguranță diferențe specifice speciei în conținutul de ADN al plantelor de fructe/semințe. PracticCu toate acestea, cel mai important factor în randamentul și viabilitatea ADN-ului pentru experimente viitoare este puritatea și contaminarea probei. Fructe și semințe specifice pot conține unul sau mai mulți dintre contaminanții de mai sus, așa că răspunsul la „Semințe sau fructe?” depinde cu siguranță de specia de plante cu care lucrați.


  • Fructele pot fi clasificate ca simple, agregate, multiple sau accesorii.
  • Fructele simple se dezvoltă dintr-un singur carpel sau carpelele topite ale unui singur ovar, în timp ce fructele agregate se dezvoltă din mai mult de un carpel găsit pe aceeași floare.
  • Fructele multiple se dezvoltă dintr-un grup de flori, în timp ce fructele accesorii nu se dezvoltă dintr-un ovar, ci din alte părți ale unei plante.
  • Părțile principale ale unui fruct includ exocarpul (coaja), mezocarpul (partea de mijloc) și endocarpul (partea interioară), aceste trei părți alcătuiesc pericarpul.
  • Fructele dehiscente își eliberează prompt semințele, în timp ce fructele indehiscente se bazează pe descompunere pentru a-și elibera semințele.
  • exocarp: învelișul exterior al pericarpului fructelor pielea
  • fructe simple: fruct care se dezvoltă dintr-un singur carpel sau carpelele topite ale unui singur ovar
  • endocarp: partea interioară a fructului
  • mezocarp: partea mijlocie a fructului
  • fruct accesoriu: un fruct care nu provine din ovar, ci dintr-o altă parte a florii

Abstract

Deși gustul este un aspect important al calității fructelor, înțelegerea noastră asupra controlului său genetic rămâne evazivă în culturile de mere și alte fructe. Analiza secvenței genomice a 497 Malus aderările au evidențiat o eroziune a diversității genetice cauzată de creșterea merelor și posibile evenimente independente de domesticire a merelor de desert și de cidru. Semnăturile de selecție pentru aciditatea și mărimea fructelor au fost detectate atât în ​​timpul procesului de domesticire, cât și de îmbunătățire, dar nu și pentru conținutul de zahăr din fructe. Mutații unice ale genelor majore care afectează gustul fructelor, inclusiv Ma1, MdTDT, și MdSOT2, scad dramatic acumularea de malat, citrat și respectiv sorbitol și corespund unor evenimente importante de domesticire. Efectele pleiotrope ale Ma1 asupra conținutului de acid organic și raportul zahăr:acid sugerează rolul său vital în determinarea gustului fructelor. Este puțin probabil ca gustul fructelor să fi fost afectat negativ de tragerea de legătură asociată cu selecția pentru fructe mai mari care a rezultat din piramidarea mai multor gene cu efecte minore asupra mărimii fructelor. Studiul nostru oferă perspective asupra bazei genetice a calității fructelor și a foii sale de parcurs evolutive în timpul domesticirii merelor și, de asemenea, subliniază genele țintă pentru manipularea genetică a gustului fructelor.


Rezultate

Identificarea la nivelul genomului CLE genele din castravete

Căutarea la nivelul genomului pentru CLE genele din castravete a fost realizată folosind alinierea. Am descărcat mai întâi proteinele CLE cunoscute ale Arabidopsis pentru a auto-construi un model CLE Markov. Prin scanarea tuturor celor 24.317 de proteine ​​care codifică castraveții din versiunea 3 a ansamblului genomului folosind modelul CLE Markov proiectat, am identificat 26 de factori de transcripție CLE (tabelul S1). Verificarea manuală a relevat factori de transcripție CLE bine conservați (referiți prin termenul „CsCLE” cu un număr de serie și sortați după valoarea E a domeniului CLE Tabelul 1). Multe peptide CLE de castravete sunt peptide scurte (90 de aminoacizi lungime), cu excepția CsCLE24 (1021 aminoacizi), CsCLE5 (416 aminoacizi) și CsCLE6 (404 aminoacizi). Greutatea moleculară a proteinelor CLE de castravete a variat de la 5293,84 (CsCLE9) la 113323,11 (CsCLE24), care este foarte asemănătoare cu cele din Arabidopsis. Majoritatea proteinelor CLE de castravete sunt alcaline cu un pI teoretic variind de la 7,09 (CsCLE17) la 12,11 (CsCLE10), cu excepția unei proteine ​​slab acide, CsCLE24 (pI = 6,52). Proteina CsCLE4 este stabilă, în timp ce altele sunt instabile. Indicele alifatic al proteinelor CLE de castravete a variat de la 49,03 (CsCLE6) la 106,78 (CsCLE17), iar indicele GRAVY a variat de la -0,935 (CsCLE9) la 0,17 (CsCLE21).

Cele 26 CLE genele au rămas distribuite pe cromozomi, inclusiv 7 pe chr5, 6 pe chr6, câte 5 pe chr1 și chr2 și câte una pe chr3, chr4 și chr7 (Fig. 1). The CLE genele CsCLE24 și CsCLE25 au fost situate extrem de aproape cu o locație intergenică scurtă de 1 kb. In afara de asta, CsCLE13 și CsCLE14 au fost, de asemenea, localizate în imediata apropiere, această descoperire a indicat că aceste gene ar putea fi duplicate în tandem. În plus, o pereche de gene, CsCLE5 și CsCLE6, cu duplicare segmentară a fost găsită în cadrul CsCLE familia, iar perechile de gene de duplicare segmentară identificate au fost distribuite pe diferiți cromozomi la castravete (Fig. 2).

Distribuția cromozomală a CLE genele din castravete. Culorile diferite ale liniilor reprezintă cromozomi diferiți și semnele de pe ele sunt genele corespunzătoare și locațiile lor

Distribuția dublării segmentare CLE genele CLE5 și CLE6 în genomul castraveților. Două gene ale aceleiași perechi de gene duplicate segmentare sunt etichetate cu roșu

Relațiile filogenetice și divergența proteinelor CLE de castravete

În studiul de față, folosim în primul rând ansamblul genomului chinezesc lung „9930”.

Doar 31 CLE genele au fost identificate (Tabelul S2) în acest raport, în timp ce un raport anterior a arătat că Arabidopsis contine 32 CLE genele [30]. Un total de 25 CLE genele au fost identificate în pepene galben (Tabelul S3) folosind abordarea computațională. Pentru a înțelege evoluția CLE genele din Cucurbitaceae și planta model Arabidopsis, am comparat genele din Arabidopsis, pepene galben și soiul de castraveți chinezesc lung „9930” (Fig. 3). Aceste CLE-uri au fost împărțiți pe baza relației lor filogenetice în șapte grupuri parafiletice (Grupurile 1 până la 7). Toate grupurile, cu excepția Grupului 2 și Grupului 6, au fost compuse din CLE-uri atât din castraveți, cât și din alte specii de plante, indicând relația strânsă dintre castraveți CLE-uri și cele ale altor plante. Distribuția castraveților CLE-uri a fost inegală în aceste grupuri. Grupul 7 a fost cel mai mare grup cu 12 membri, reprezentând aproape jumătate din castraveți CLE-uri, urmată de Grupele 1 și 5 care conțin 6 și 5 castraveți CLE-uri, respectiv. Cele mai puțin reprezentate subfamilii au fost Grupele 2 și 6 fără castraveți CLE-uri.

Analiza filogenetică a CLE gene din Arabidopsis, castraveți și pepene galben. Analiza a implicat 26 de secvențe de proteine ​​CLE de castravete, 31 Arabidopsis Secvențe de proteine ​​AtCLE și 25 de secvențe de proteine ​​CLE de pepene galben. Stelele roșii reprezintă castravetele proteinele CLE pătratele albastre reprezintă Arabidopsis Proteinele CLE și cercurile verzi reprezintă proteinele CLE de pepene galben

Structura genică a castraveților CLE genele

Pentru a compara genele de castravete, au fost prezise structurile exon-intron (Fig. 4). Arborele filogenetic a fost construit prin metoda Maximum-Likelihood folosind secvența proteică conservată a castraveților CLE genele. Paisprezece CLE genele au fost gene cu un singur exon, zece au fost gene cu dublu exon și una a fost o genă cu triplu exon. Modelele exon-intron din cadrul aceluiași grup de clasificare filogenetică au arătat similitudini. Gena castraveților CLE24 a fost unic cu regiunile sale de codificare discrete împărțite cu 19 introni.

Structurile exon-intron prezise ale castraveților CLE-uri și motive conservate ale proteinei CLE de castravete. A Arborele filogenetic a fost construit pe baza secvențelor de proteine ​​de lungime completă a 26 de proteine ​​CLE de castravete folosind software-ul MEGA V6.06. b Motive conservate în proteinele CLE de castravete. Motivele, numerele 1–10, au fost afișate în casete colorate diferit. c Structura exon-intron a castraveților CLE genele. Exonii și intronii sunt indicați prin casete verzi și, respectiv, linii simple

Motive proteice CLE de castravete conservat

Software-ul MEME a fost folosit pentru a explora domeniile și motivele conservate ale proteinelor CLE din castravete. Motivele au fost listate de la motivul 1 la 10 în funcție de valoarea E ascendentă a aliniamentului (Fig. 4). Aproape toate proteinele CLE de castravete au conținut motivul 1, care reprezintă un domeniu CLE tipic lângă C-terminal, cu excepția CsCLE9. Proteinele CsCLE5 și CsCLE6 au fost diferite la C-terminal ambele au conținut motivul 4 lângă domeniul CLE C-terminal. Proteina CsCLE11 conținea patru motive 6 localizate în tandem și un domeniu CLE, în timp ce CsCLE24 conține două motive 2 în tandem. Aceste rezultate au indicat că caracterizarea secvenței și funcția biologică au fost foarte diferite între proteinele CLE de castravete din fiecare ramură a arborelui filogenetic. Aceste proteine ​​posedau și alte domenii funcționale la N-terminal sau la mijloc, în timp ce domeniul lor CLE era funcțional în căile semnalului.

Elemente de reglementare cis din amonte (CRE)

În baza de date PlantCARE, secvența de 1500 bp în promotorul din amonte a fost utilizată pentru a localiza elementul de reglare cis în regiunea de reglare din amonte. Prin analizarea funcțiilor biologice ale CRE-urilor în regiunea din amonte a 26 de castraveți CLE gene, se poate concluziona că majoritatea componentelor, altele decât cele necesare pentru exprimarea normală a promotorilor, cum ar fi AT

TATA-Box și CAAT-Box, pot fi împărțite în următoarele patru categorii. 1) Primul tip de element este elementele de răspuns hormonal, cum ar fi ABRE (element de răspuns ABA), elementul TCA (elementul de răspuns la acid salicilic), TATC-Box (elementul de răspuns la giberelină) și elementul TGA (răspunsul la auxină). element), printre altele. Aceste elemente au fost reprezentate grafic în acest experiment (Fig. 5). 2) Al doilea tip de element sunt elementele sensibile la lumină, cum ar fi ACE, G-box, ATA-motiv, LAMP-element etc. 3). Al treilea tip de element sunt elementele de expresie meristematică. De exemplu, HD-zip1 (elementele legate de diferențierea celulelor mezofile) și TGACG-motivul (elementele legate de dezvoltarea meristemului) joacă un rol important în reglarea genei CLE a menținerii meristemului plantelor și organogenezei. 4) Al patrulea tip este elementele de răspuns la stres, cum ar fi ARE, MBS, repetiții bogate în TC, LTR etc., precum și alți factori de reglare care joacă un rol în reglarea metabolică.

Elemente de răspuns hormonal în amonte de castraveți CLE-uri. Elementele care răspund la hormoni sunt afișate în casete colorate diferit

Perechi omoloage de proteine ​​CLE de castravete

Pentru a înțelege descendența verticală dintr-o singură genă ancestrală și duplicarea, a fost efectuată o analiză comparativă pentru a identifica perechile de gene ortologe, co-ortologe și paraloge în Arabidopsis, castraveți și pepene galben.

Software-ul OrthoMCL a identificat 24 ortologe, 23 co-ortologe și 8 paraloge CLE perechi de gene între Arabidopsis, castraveți și pepene galben. Această rețea de perechi de gene omoloage a fost foarte în concordanță cu arborele filogenetic, care este clar împărțit în trei părți. Genele ortologe dintre aceste trei specii sunt prezentate în Fig. 6. Din 26 de castraveți CLE gene, 15 gene ortologe la pepene galben și 7 in Arabidopsis au fost găsite.

Perechi de gene omoloage în Arabidopsis, castraveți și pepene galben. Liniile gri reprezintă toate perechile omoloage dintre diferiți genomi, iar liniile roșii reprezintă perechile omoloage ale CLE familie de gene

Timp de selecție și divergență

Pentru a investiga mecanismele de selecţie a CLE genele în timpul evoluției, am calculat Ka, Ks și timpul de divergență al perechii omoloage CsCLE24-CsCLE25 (Tabelul S4). Această pereche a avut un Ka de 1,08 și Ks de 0,82 și un raport Ka/Ks de 1,31 cu un P-valoare de 0,0098, indicând că această pereche de gene suferă o selecție pozitivă care a condus la diferențierea funcțională.

Modelul de expresie al castraveților CLE genele în timpul dezvoltării

Am investigat expresia fiecăruia CLE genă folosind date publicate de ARN-seq (Tabelul S5) pentru 23 de țesuturi diferite de castraveți în timpul dezvoltării vegetative și reproductive. Nivelul de expresie al fiecărei gene a fost normalizat folosind metoda RPKM. Zece castraveți CLE gene inclusiv CsCLE1, 2, 4, 5, 14, 25, 24, 23, 15, și 17 au arătat niveluri relativ scăzute de expresie în toate cele 23 de probe, arătând că au jucat un rol neglijabil în procesele de dezvoltare la castraveți. Genele CsCLE9, 10, 18, și 22 a arătat niveluri relativ ridicate de expresie în mai multe probe (Fig. 7a).

Modelul de expresie al castraveților CLE genele. A Harta termică reprezentând profilul de expresie al castraveților CLE gene în timpul diferitelor etape de dezvoltare analizate prin date ARN-seq. b Harta termică reprezentând profilul de expresie al castraveților CLE gene în timpul diferitelor stadii de dezvoltare validate prin qPCR în chineză lungă „9930”

Folosind qPCR, am analizat expresia castraveților CLE gene (Tabelul S6) în diferite țesuturi ale răsadurilor lungi „9930” chinezești. Din 26 de castraveți CLE gene, 24 de gene au fost detectate în 21 de probe. Genele CLE1, 2, 7, 8, 9, 17, 18, 19, și 26 au fost exprimate la niveluri relativ scăzute în toate probele, iar altele au fost exprimate la niveluri relativ ridicate în cel puțin un eșantion. Castravete CLE genele au arătat niveluri relativ ridicate de expresie în țesuturile în creștere, inclusiv punct, tulpină și floare, și niveluri relativ scăzute de expresie în rădăcină. Nivelul de expresie al CsCLE4, 6, 11, 14, 21, 23, 24, și 25 a fost cea mai înaltă (Fig. 7b). Rezultatele qPCR sunt foarte în concordanță cu fostele date ARN-seq disponibile în baza de date publică.

Supraexprimarea heterologă a CsCLV3 genă în Arabidopsis

Vectorul de expresie a fost construit cu succes prin purtarea genei țintă pe plasmida PHB și apoi CsCLV3 gena, gena reprezentativă a CLE familie, a fost supraexprimat în Arabidopsis ne referim la aceste plante transformate ca tulpină pozitivă. Rezultatele au arătat că în fenotipul tulpinii pozitive slăbiciunea sa dezvoltat la punctul de creștere. În comparație cu tipul sălbatic, diametrul punctului de creștere al tipului sălbatic Arabidopsis a fost de aproximativ 0,66 mm (Fig. 8a), iar cea de CsCLV3 Tulpina pozitivă a supraexpresiei genelor a fost de aproximativ 0,54 mm (Fig. 8b). În aceleași condiții, punctul de creștere al tulpinii pozitive a fost mai mic decât cel al tipului sălbatic.

Punctul de creștere al supraexprimării heterologe a CsCLV3 genă în Arabidopsis. A Punct de creștere de tip sălbatic. A Diametrul punctului de creștere pentru tipul sălbatic este de 0,6584168 mm. b Punctul de creștere al tulpinii pozitive. b Diametrul punctului de creștere pentru deformarea pozitivă este de 0,5429444 mm. Diametrul punctului de creștere a fost măsurat cu software-ul IPwin 32

După transplantare, aproape toate plantele transformate din generația T1 au prezentat fenomene de slăbiciune evidentă a dezvoltării punctului de creștere, lipsă de șuruburi și o capacitate de creștere a plantelor în scădere (Fig. 9). Semințele ereditare obținute din plantele T1 au fost extrem de puține, făcând analiza funcțională în generațiile ulterioare imposibilă. În plus, puține dintre tulpinile pozitive au finalizat procesele de creștere și dezvoltare. În acest studiu, doar două tulpini înșurubate au arătat că fie păstaia nu s-a dezvoltat, fie păstăia a fost scurtă, iar dezvoltarea sa a fost semnificativ inferioară celei de tip sălbatic (Fig. 10a). Zece transformanți au fost selectați aleatoriu pentru detectarea PCR cantitativă prin fluorescență (Fig. 10b). Rezultatele (Tabelul S7) au arătat că genele țintă au fost exprimate în toate materialele transgenice, iar fenotipul nr. 15 și nr. 8 cu expresie mai scăzută a fost cel mai slab, care ar putea da roade, dar nu o mare capacitate de fructificare. În același timp, No.1, 12 și 13, care aveau niveluri ridicate de expresie, aveau fenotipuri capabile și un grad ridicat de anomalie și nu au putut să se dezvolte sau să fructifice. În general, nivelul de expresie al CsCLV3 gena este în concordanță cu fenotipul ei. Rezultatele experimentale au demonstrat că castravetele CLV3 genele funcționează într-un mod esențial în controlul dezvoltării punctelor de creștere și a fructelor și a înșurubării plantelor.

Supraexprimarea heterologă a CsCLV3 genă în Arabidopsis. Tulpina de tip sălbatic (WT) are un ciclu normal de creștere și dezvoltare și o structură fenotipică a frunzelor, tulpinilor, frunzelor, păstăilor și așa mai departe. Tulpina pozitivă (4910–13) a fost fenomenul de supraexpresie heterologă a CsCLV3 genă și nu are tulpină, frunză, păstaie de fructe sau alte structuri morfologice, prezentând doar frunze de rozetă șifonate

Păstăi cu expresie mai scăzută în tulpini pozitive. A Fenotipurile de păstăi de tip sălbatic (col-0) și colorarea pozitivă (4910–15) ar putea să se înșelească, dar nu să dea roade, în timp ce 4910–8 ar putea să dea roade, dar internoduri au fost mai scurte decât în ​​WT. Fenotipurile de păstăi ale Arabidopsis au fost observate la microscopul Nikon D3300. Benzile prezentate în figură sunt expresia genelor corespunzătoare fenotipurilor. b Zece transformanți au fost selectați aleatoriu pentru detectarea PCR cantitativă prin fluorescență


Care este diferența dintre ADN-ul vegetal și ADN-ul animal?

În centrul fiecărei celule vegetale, de la alge la orhidee – și în centrul fiecărei celule animale, de la meduze la tine și la mine, – există o copie a materialului genetic al organismului. Acest ADN poartă un model complet al organismului. Este ceea ce transferă caracteristicile de la o generație la alta.

Există diferențe destul de evidente între plante și animale, dar – la nivel chimic – celulele tuturor plantelor și ale tuturor animalelor conțin ADN în aceeași formă – faimosul “dublu helix” care arată ca un scara rasucita. În plus, toate moleculele de ADN, atât din plante, cât și din animale, sunt făcute din aceleași patru blocuri chimice, numite nucleotide.

Ceea ce este diferit este modul în care sunt aranjate aceste patru nucleotide din ADN. Secvența lor este cea care determină ce proteine ​​vor fi produse. Modul în care sunt aranjate nucleotidele și informațiile pe care le codifică, decid dacă organismul va produce solzi sau frunze - picioare sau o tulpină.

Cercetările arată că plantele și animalele pot produce unele proteine ​​în comun. Un exemplu proeminent este cunoscut sub numele de Citocromul C. Dar, deoarece procesul de copiere a ADN-ului este imperfect, greșelile se acumulează în timp, ceea ce face ca Citocromul C să fie ușor diferit la diferite creaturi. Regiunile genelor care specifică secvența de aminoacizi în citocromul C uman sunt mai asemănătoare cu cele ale unui alt mamifer, cum ar fi un iepure, și mai puțin asemănătoare cu o creatură mai îndepărtată din punct de vedere evolutiv, precum o floarea soarelui.

Schema clasificării animalelor și plantelor în regate se confruntă cu concurență. Mai recent a apărut un sistem alternativ, bazat pe informații evolutive și moleculare. Citocromul c este probabil molecula canonică sau paradigmatică în această abordare.

Fiecare specie are un număr caracteristic de cromozomi, numit număr de cromozomi. Animalele au mai mulți cromozomi plantele au mai puțini.


Utilizarea asemănărilor din ADN pentru a clasifica organismele

Cu toate acestea, datorită tehnologiei moderne, analiza relațiilor genetice dintre specii și organisme este acum posibilă și a condus la a privi diferit relațiile dintre formele de viață. În 1990, Carl Woese a propus „Sistemul în trei domenii” de clasificare bazată pe asemănările genetice dintre organisme. Sistemul arată un strămoș comun al întregii vieți împărțit în trei domenii largi: Bacterii, Archaea și Eucariote (organismele cu un nucleu pentru a-și stoca ADN-ul).

Examinând genele diferitelor specii, atât animale, cât și ciuperci, pot fi observate schimbări mutaționale și pot fi determinate relații genealogice care se întind de milioane de ani.

După cum se dovedește, animalele și ciupercile împărtășesc un strămoș comun și s-au îndepărtat de plante cu aproximativ 1,1 miliarde de ani în urmă. Numai mai tarziu s-au separat animalele și ciupercile în arborele genealogic al vieții, făcând ciupercile mai strâns legate de oameni decât de plante. Cel mai probabil, acest strămoș comun a fost un organism unicelular care a prezentat caracteristici asemănătoare spermatozoizilor (ca un animal) și apoi o etapă de dezvoltare ulterioară cu un perete celular mai puternic (ciuperci).

Un arbore filogenetic bazat pe analiza ARNr. În partea dreaptă, observați divergența plantelor, ciupercilor și animalelor. (Credit foto: Sting &ndash fr: Sting/Wikimedia Commons)

Ciupercile sunt legume?

Raspuns simplu? Nu, o ciupercă nu este o legumă. Ciupercile sunt corpuri fructifere ale ciupercilor filamentoase macroscopice. Când a apărut pentru prima dată micologia (studiul ciupercilor), a făcut parte din botanică, deoarece ciupercile erau considerate plante primitive.

Principala diferență dintre o plantă (legumă) și o ciupercă este modul în care își dobândesc hrana. Plantele posedă clorofilă și își produc hrana prin fotosinteză. Ciupercile există pe materialul în descompunere în natură. În plus, există diferențe structurale evidente, cum ar fi lipsa frunzelor, rădăcinilor și semințelor. Astfel, ciupercile au acum propriul regn bazat pe organizarea celulară.

Cu toate acestea, aceasta este latura științifică a lucrurilor, dar să aruncăm o privire la cealaltă parte și mâncarea! În viața de zi cu zi, nu folosim știința pentru a ne clasifica alimentele. Roșiile și castraveții sunt din punct de vedere științific fructele unei plante, dar le numim totuși legume. În mod similar, ciupercile nu sunt legume sau fructe, sau chiar carne. Ele sunt în sine o categorie diferită, dar pentru comoditate, le punem împreună cu legume.

Diferite tipuri de ciuperci au diverse beneficii pentru sănătate. La un moment dat în istorie, ciupercile erau atât de apreciate încât era de fapt interzis oamenilor de rând să le mănânce! Erau rezervate doar familiilor regale.


Conținutul de ADN din semințele plantelor vs. pulpa fructelor - Biologie

Cât de mult ADN împart plantele cu oamenii? Peste 99%?

Acesta este un număr cu care trebuie să fim atenți.

În primul rând, există un singur tip de ADN! TOATE animalele și plantele au același ADN, care este practic un cod de doar 4 „litere” care codifică aceiași aminoacizi din care sunt făcute toate proteinele. Există o complicație că unii aminoacizi au mai mult de un cod care îl specifică - există o mulțime de exemple în care o schimbare a codurilor (de exemplu, o mutație) poate duce la NICIO SCHIMBARE a aminoacidului care este specificat.

Nu este surprinzător că toate animalele și plantele au majoritatea GENelor lor în comun. Mecanismul prin care zaharurile sunt oxidate pentru a-și elibera energia (respirația) este aproape universal. Există zeci de enzime implicate numai în acest proces. Fiecare enzimă este o proteină și fiecare trebuie să fie codificată în ADN. Există multe enzime implicate în replicarea ADN-ului în sine. Alte procese sunt și ele aproape universale.

Pe de altă parte, unele gene sunt foarte semnificative. Cred că există o singură genă responsabilă pentru a pune un embrion uman pe drumul spre masculinitate, mai degrabă decât spre feminitate. Cu toate acestea, această genă acționează ca un comutator și direcționează alte gene pentru a produce o gamă uriașă de diferențe între bărbați și femei.

Unele gene sunt prezente, dar nu sunt niciodată folosite (niciodată activate). Se pare că există o cantitate imensă de ADN pe care am moștenit-o din trecutul nostru și acesta poate să nu mai fie util, dar nu a fost „înlăturat”. Unele gene sunt întrerupte de lungi întinderi de ADN „tăcut” pentru care nu cunoaștem o funcție. S-ar putea să fi cartografiat întregul genom al câtorva organisme (oameni, Aarabidopsis etc), dar aceasta este puțin mai mult decât o „foaie de parcurs” și încă trebuie să identificăm „casele” și, mai semnificativ, „locuitorii” acestora. case.

Veți ști că amprenta ADN poate identifica un individ de altul. Există în mod clar porțiuni de ADN pe care nici măcar nu le împărtășim cu rudele noastre (cu excepția gemenilor identici) - cu cât relația este mai strânsă, cu atât împărtășim mai multe „benzi” de pe amprenta noastră. Copiii mei împărtășesc doar jumătate din amprenta mea ADN.

Se spune că împărtășim aproximativ 60% din genele noastre cu o banană. Dar puteți vedea că o astfel de afirmație poate fi foarte înșelătoare.

Au existat câteva studii interesante asupra proteinelor pe care TOATE organismele le împărtășesc. Unul dintre acestea este citocromul C care este implicat cu o parte a respirației. Numărul de aminoacizi/mutații diferiți dintre om și alte organisme a fost studiat pe larg. Informații de acest fel pot da o diferență numerică între om și alte specii (inclusiv plante). Cu toate acestea, aceste diferențe nu sunt în partea de moleculă care contează - partea de moleculă care permite citocromului C să-și îndeplinească funcția. Astfel de date sunt utile pentru studii pentru a spune cât de strâns sunt legate organismele (și într-adevăr ne vorbesc despre relațiile din cadrul acelui copac), dar ele nu ne spun cât de „diferiți” suntem, deoarece Citocromul C funcționează LA ACEȘI în TOATE organismele!


Cum apar fructele fără semințe și cum sunt înmulțite?

Dezvoltarea fructelor începe în mod normal atunci când unul sau mai multe ovule din compartimentul ovular al florii sunt fertilizate de nucleii de spermatozoizi din polen. La unele plante însă, fructele se dezvoltă fără fertilizare, fenomen cunoscut sub numele de partenocarpie. Fructele partenocarpice au avantaje față de fructele cu semințe: termen de valabilitate mai lung și atractivitate mai mare pentru consumatori.

Cele mai frecvente motive pentru lipsa dezvoltării semințelor sunt eșecul polenizării sau ouăle sau spermatozoizii nefuncționale. La multe plante, genele de auto-incompatibilitate limitează fertilizarea de succes la polenizarea încrucișată între părinți de sex masculin și feminin diferiți genetic. Această proprietate este exploatată de fermierii de citrice care cultivă fructe fără semințe, precum portocalele de buric și clementinele. Deoarece aceste soiuri sunt auto-incompatibile, nu reușesc să stabilească semințe atunci când sunt plantate în livezi de plante identice (clone). Aceste plante au o frecvență mare de partenocarpie, totuși, deci produc în continuare fructe. Astfel de copaci nu necesită semințe pentru înmulțire. De fapt, înmulțirea prin sămânță ar fi dezavantajoasă deoarece descendența ar diferi de părinte. În schimb, pepinierele înmulțesc frecvent pomii fructiferi asexuat, de obicei prin altoire.

Un alt motiv frecvent pentru lipsa fertilizării reușite este dezechilibrul cromozomial. De exemplu, banana comună este triploid. Cu alte cuvinte, are trei seturi de cromozomi. În loc să aibă un set de cromozomi de la fiecare părinte, are două seturi de la un părinte și unul de la celălalt părinte. Triploizii produc rareori ouă sau spermatozoizi care au un set echilibrat de cromozomi, așa că un set de semințe de succes este foarte rar. Bananele, de asemenea, sunt partenocarpice și produc fructe în absența fertilizării cu succes. Aceste banane sunt înmulțite asexuat. După ce tulpina a înflorit și a dat roade, moare. Dar există lăstari laterali sau ventuze la baza tulpinii principale, care pot fi îndepărtați și replantați pentru a continua cultivarea. De asemenea, cultivatorii propagă bananele prin cultura de țesut.

Pepenii fără semințe sunt deosebit de interesanți pentru că trebuie să fie înmulțiți prin semințe și totuși cultivatorii pot încă exploata partenocarpia. O modalitate de a face pepeni fără semințe este de a produce semințe triploide. Ca și în cazul bananelor, pepenii verde nu pot produce semințe funcționale, dar totuși dezvoltă fructe bune prin partenocarpie. Crescătorii de plante produc semințe triploide prin încrucișarea unui părinte diploid normal cu un părinte tetraploid, care în sine este obținut prin manipularea genetică a diploidelor pentru a-și dubla numărul de cromozomi. În cazul pepenilor verzi, această manipulare trebuie efectuată în fiecare generație, deci este o propunere oarecum costisitoare, dar totuși utilă.

Biologii de plante au aflat că, dacă hormonul vegetal auxina este produs devreme în dezvoltarea ovulelor, fructele partenocarpice pot crește pe plante care nu prezintă de obicei această proprietate. Astfel, ingineria genetică va oferi consumatorilor fructe partenocarpice în multe alte specii în viitorul apropiat.


Discuţie

P. trifoliata este o specie chineză de foioase cu frunze trifoliolate care a fost folosită de mult timp ca portaltoi pentru soiurile de citrice. Este rezistent la Phytophthora, nematode și virusul tristeza și poate rezista la o temperatură rece de -26 °C 50,51 . Oamenii antici au observat că uniunea grefa a mandarinei și P. trifoliata cultivat în sudul Chinei a fost mandarin, în timp ce în nordul Chinei, uniunea de altoi crescută a fost portocaliu trifoliat. Acest lucru este acum ușor de explicat, deoarece doar portocalul trifoliat de portaltoi este foarte rezistent la temperaturi scăzute și poate supraviețui în timpul iernii în China de Nord, în timp ce mandarina cu fructe de bună calitate este vulnerabilă la temperaturi scăzute. P. trifoliata este, de asemenea, compatibil sexual cu Citrice genul, iar hibridul sexual cel mai răspândit este Troyer citrange, care este, de asemenea, un portaltoi de citrice foarte important în multe țări 23 . În acest studiu, am secvențiat și asamblat un genom de înaltă calitate al unei rase locale de P. trifoliata din provincia Shanxi pe baza evaluării genetice a unui set de 169 de accesări. Astfel, acest genotip reprezintă un tip original de P. trifoliata În plus, față de fondul genetic îngust din Statele Unite, acest genom este mai complet decât genomul 52 recent publicat (Tabelul suplimentar 6). Ambii genomi oferă o resursă genomică valoroasă pentru genetica portaltoiului de citrice și îmbunătățirea reproducerii. Acest genom împreună cu genomul plantelor de citrice cultivate (ca descendenți) ar trebui să faciliteze o înțelegere profundă a interacțiunilor pui-portotoi la nivel genomic. În plus, informațiile genomice pot fi, de asemenea, valoroase pentru investigarea ulterioară a bazei utilizărilor medicale și a altor trăsături biologice unice ale portocalului trifoliat, cum ar fi rezistența la frig, caracterul frunzelor trifoliate și rezistența la virusul tristeza citricelor.

Altoirea a fost utilizată pe scară largă pentru a îmbunătăți performanța plantelor horticole de mii de ani. Deși dovezile fiziologice din ce în ce mai mari indică existența interacțiunilor portaltoi-spin la plante 53 , dovezile moleculare la nivel genetic și epigenetic care dezvăluie influența interacțiunilor portaltoi-spon sunt rare. Recent, descoperirea elementelor genetice mobile, cum ar fi ADN-ul, ARN-ul și proteinele a dezvăluit treptat mecanismele moleculare care stau la baza mai multor trăsături agronomice afectate de interacțiunile portaltoi-spon 16 . De exemplu, microRNA399 a fost identificat ca un semnal la distanță lungă pentru reglarea homeostaziei fosfatului vegetal la rapiță și dovleac 54 . Epigenetic modification may also play important roles in creating heritable phenotypic variation by grafting. In this study, we found that the DNA methylation level in the scion grafted on P. trifoliata decreased by

3% (Fig. 5). A previous study reported that DNA methylation levels in grafted cucumber and melon were significantly increased when pumpkin was used as rootstock, while there was no significant change in grafted watermelon 19 . Grafting between plant species of Solanaceae caused extensive DNA methylation variation, and some variation could be stably passed on to offspring 18 . Thus, we can conclude that grafting does cause variations in DNA methylation, but the degree and trend of DNA methylation variation may vary based on species and graft combinations. The effect of grafting on DNA methylation may be a regulatory mechanism for intercell interactions between scions and rootstocks 21 .

Our observation that the DNA demethylation pattern in the scions of heterografted plants is concomitant with reduced abundance of 24-nt sRNAs implies a possible mechanism of graft-induced alteration in DNA methylation. sRNA-mediated graft-transmissible epigenetic modifications have been confirmed in Arabidopsis thaliana by grafting experiments. Molnar et al. demonstrated that the movement of transgene-derived and endogenous sRNAs from shoot to root across graft unions can cause epigenetic changes in rootstock cells 55 . A subsequent study showed that mobile sRNAs originating in the shoots guided RdDM at thousands of loci in the roots 56 . Our finding that the sRNAs are associated with the methylation levels of the sRNA-overlapping regions suggests that the DNA demethylation in the scion of heterografted plants may be attributed to the reduction in sRNAs leading to reduced RdDM. As the genotypes of both the rootstock and scion in autografted plants are the same, it is difficult to determine whether the highly expressed sRNAs in the scions of autografted plants are from the rootstock. However, the higher expression of the sRNAs in the roots of sweet orange than in those of Poncirus, combined with the downregulation of the highly expressed sRNAs in the scions of autografted plants after griding treatment, suggested the possibility that the reduction in the rootstock-to-scion movement of sRNAs leads to decreased sRNA abundance in the scions of heterografted plants. Based on the above finding, the DNA demethylation in the scion of SWO/Pt was possibly caused by the reduced graft-transmissible epigenetic modifications mediated by rootstock-to-scion movement of sRNAs.

The high-quality citrus rootstock genome provides an important basis for future studies on rootstock genetic improvement, and our multiomic analysis of P. trifoliata may promote a deeper understanding of graft biology, not only in citrus plants but also in other horticultural crops. Given the important biological roles played by DNA methylation in plants, it is reasonable to suspect that graft-transmissible epigenetic modifications may have functional consequences. In the future, the use of transgenic plants as rootstocks for grafting will further enhance the opportunity to improve practical nontransgenic cultivars in the field.


METODE

Plant Materials and Phenotypic Evaluation

Diploid Fragaria vesca Germplasm

An F2 mapping population of 145 lines between the everbearing, non-runnering Fragaria vesca cv Reine des Vallées (ESP138.660 RV660) and the WF F. vesca ESP138.596 (WV596) was developed from one F1 plant (F1-14) that was able to produce runners and had RFs. The population was grown in a greenhouse in Málaga, Spain and phenotyped for two years. The two traits, runnering and red/white fruits, were found to segregate independently as two single mutations. The remaining F. vesca accessions were grown under the same conditions and are described in Supplemental Data Set 3 and include cv South Queensferry, GER1, and GER2 from the Günter Staudt collection (Dresden, Germany) and UK13, SE100, and FIN12 from the T. Hytönen and D. Posé collection.

Octoploid Fragaria Germplasm

The University of Florida breeding population 17.66 was derived from a cross between FL 13.65-160 (red) and FL 14.29-1 (white) selections ( Supplemental Figure 4 Supplemental Data Sets 3 and 8 ). The population (102 individuals) was grown under open field conditions with two plants per plot. Fruit skin color was assayed three times from December 2018 to February 2019 at the UF/IFAS Gulf Coast Research and Education Center (Balm, Florida).

To generate the SS×FcL F2 population of 105 progenies, a cross between Fragaria ×ananassa cv Senga Sengana and F. chiloensis ssp. lucida USA2 was performed at Hansabred, Germany in 2008 ( Supplemental Figure 5 ). An F1 seedling, cloned under the number P-90999, was selected among the progeny based on key breeding traits such as tolerance to two spotted spider mite (Tetranychus urticae Koch), yield, and fruit aroma and color. The selected F1 individual was self-pollinated to obtain the F2 mapping population. The population was grown under field conditions at Hansabred and scored for fruit skin, flesh, and core color in three seasons (2014, 2016, and 2019). Skin color was evaluated using a five-score scale from completely white to dark red. Flesh and core color was evaluated using a three-score scale: 1, white 2, light red and 3, red ( Supplemental Figure 10 ). The parental line F. chiloensis ssp. lucida USA2 is a male individual that does not set fruit, and therefore USA1, a sister female plant collected from the same area, was included in phenotypic and molecular analyses, as were other F. chiloensis accessions from diverse origins ( Supplemental Data Set 3 ).

DNA Extraction and QTL-Seq Analysis of Diploid Fragaria vesca

DNA was extracted from young leaves of parental plants, F1 plants, and each F2 line using the CTAB method ( Doyle and Doyle, 1990) with minor modifications. For rapid mapping of the fruit color mutation, we performed whole-genome resequencing of DNA from two bulked populations as previously described by Takagi et al. (2013). The RF and WF pools were produced by mixing equal amounts of DNA from 34 RF and 32 WF F2 lines, respectively.

Pair-end sequencing libraries with insert sizes of ∼350 bp were prepared, and 100-bp sequences were produced with 50× genome coverage using an Illumina HiSeq 2000. The reads from the RF and WF pools were mapped independently against the latest version of the Fragaria vesca reference genome, F_vesca_H4_V4.1 ( Edger et al., 2018). The low-quality reads (<Q20 Phred scale) were filtered using the samtools method ( Li et al., 2009). Duplicates that originated from PCR were eliminated using the picard-tools program.

For the single nucleotide variants and small INDELs calling process, the gatk algorithm ( McKenna et al., 2010) was applied. The large INDELs were identified using the Manta algorithm ( Chen et al., 2016). The variants with coverage less than 20 reads in both samples were not considered in downstream analyses.

SNP frequencies in each pool were calculated as the proportion of reads harboring the SNP different from the reference genome. Thus, SNP frequency = 0 if all short reads match the reference sequence and 1 if they correspond to the alternative allele. SNP positions with read depth <7 and frequencies <0.3 in both pools were excluded, as they may represent spurious SNPs called due to sequencing or alignment errors. The parameter ΔSNP-index was calculated as the absolute difference between SNP frequencies in the RF and WF pool samples. To detect significant genomic regions, the genome was split into 3-Mb sliding windows with 10-kb increments. For each window, the average ΔSNP-index was calculated and used for the sliding window plot. To identify statistically significant regions, a Wilcoxon test was applied using a confidence P-value of 0.03.

Whole Genome Resequencing of FIN12 and Data Analysis

Whole genome resequencing of the FIN12 accession was performed at DNA Sequencing and Genomics Laboratory, Institute of Biotechnology, University of Helsinki, Finland using an Illumina NextSeq 500 sequencer. Library preparation, pair-end sequencing (150 + 150 bp), and the alignment of the sequencing reads on the F. vesca H4 reference genome v4.1 ( Edger et al., 2018) were performed as described by Koskela et al. (2017).

GWAS Analysis of F. × ananassa Breeding Germplasm

A total of 95 individuals from UF family 17.66 were used for GWAS. Total genomic DNA was isolated from leaf tissues using a modified CTAB method described by Noh et al. (2018). Whole-genome SNP Genotyping was performed using the FanaSNP 50K Array ( Hardigan et al., 2020). A GLM, mixed linear model (MLM), and MLMM were used for association tests using GAPIT v2 performed in R ( Team, 2014 Liu et al., 2016 Tang et al., 2016). Manhattan plots were created using the R package qqman version 0.1.4 ( Turner, 2014).

Linkage Mapping and Detection of QTL in Octoploid Fragaria

DNA was extracted from young leaves of parental plants, F1 plants, and the 105 F2 lines using the same CTAB method described for diploid Fragaria. A total of 16,070 SNP markers were produced using the strawberry DArTseq platform ( Sánchez-Sevilla et al., 2015). SNP markers that were monomorphic in the progeny were removed, and markers that did not fit the expected 3:1 segregation ratio using the χ 2 test (P = 0.05). Next, markers with rowSums <400 were also removed. Finally, markers with more than 5% missing scores (more than five progeny lines) were excluded, resulting in a total of 9005 dominantly scored SNP markers. For 5856 markers, the reference and the alternative allele segregated at a 1:2:1 ratio (as expected for a F2 population) and were transformed into 2523 codominant markers (COD-SNPs). The 2523 COD-SNPs were used together with 2446 dominant SNPs (DOM-SNPs) for mapping using JoinMap 4.1 ( van Ooijen, 2006). First, JoinMap software was used (coding the markers as a CP population) to infer the phases of markers heterozygous in both parental lines and thus of unknown origin in the F1 linia. Phase information was then used to assign phases and to code the SNP markers as a F2 populatia. Grouping was performed using independence LOD and the default settings in JoinMap 4.1, and LGs were chosen at a LOD of 9 for all 28 groups obtained. Map construction was performed using the maximum likelihood mapping algorithm and the following parameters: chain length 5,000, initial acceptance probability 0.250, cooling control parameter 0.001, stop after 30,000 chains without improvement, length of burn-in chain 10,000, number of Monte Carlo EM cycles 4, chain length per Monte Carlo EM cycle 2,000, and sampling period for recombination frequency matrix samples 5. A total of 422 identical loci and 517 loci with similarity > 0.99 were removed. The seven HGs were named HG 1 to 7 based on the corresponding LGs in the diploid Fragaria reference map. BLAST analysis was performed using the SNP marker sequences as queries against the recently published Camarosa genome and assigned to the best matching chromosome. LGs within homoeologous groups were then named 1 to 4 according to the corresponding Camarosa chromosome number ( Edger et al., 2019).

QTL analyses were performed using MapQTL 6 ( van Ooijen, 2009). The raw relative data were first analyzed using a nonparametric Kruskal-Wallis rank-sum test. A stringent significance level of P ≤ 0.005 was used as a threshold to identify markers linked to QTLs. Second, transformed data sets for nonnormally distributed traits were used to identify and locate mQTLs using Interval Mapping with a step size of 1 cM and a maximum of five neighboring markers. Significance LOD thresholds were estimated with a 1,000-permutation test for each trait. The most significant markers were then used as cofactors for restricted multiple QTL mapping analysis. mQTLs with LOD scores greater than the genome-wide threshold at P ≤ 0.05 were declared significant. Linkage maps and QTLs were drawn using MapChart 2.2 ( Voorrips, 2002).

RNA Extraction and RT-quantitative PCR

Total RNA was extracted from three independent pools (20 to 25 ripe fruits each) of each WF and RF phenotype. Fruits for these biological triplicates were collected from the same F2 lines of the ‘RV660’ × ‘WV596’ population used for QTL-seq. We followed a CTAB method described by Gambino et al. (2008), with minor modifications. Briefly, 300 mg of powdered fruit sample was used as starting material and RNA was resuspended in 30 μL sterile water. Following digestion with a TURBO DNA-free Kit (Thermo Fisher Scientific AM1907), cDNA was synthesized from 1 μg of RNA using a High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Thermo Fisher Scientific 4,368,814). RT-qPCR analysis was performed with iQ SYBR Green Supermix in an iCycler iQ5 system (Bio-Rad) following the manufacturer's instructions. Three technical replicates (within each experiment) were performed for each biological replicate. The relative expression level of a gene of interest in each sample was calculated as E -ΔCq and normalized by the E -ΔCq value for GADPH as the internal reference gene. The sequences of primers used in this study are listed in Supplemental Data Set 11 .

Semi-polar Metabolite Analysis Using UPLC-Orbitrap-MS/MS

To investigate the effect of FvMYB10 mutation, three independent pools of 20 to 25 ripe fruits from each phenotype (RF and WF) were analyzed. Fruits were collected from the same F2 lines used for QTL-seq and RT-qPCR. Fruit tissue from each pool was ground in liquid nitrogen and stored at −80°C. Secondary metabolite profiles of RF and WF pools were obtained as described by Vallarino et al. (2018) using a Waters Acquity UPLC system. Full documentation of metabolite profiling data acquisition and interpretation is provided in Supplemental Data Set 2 .

Quantification of Fruit Quality Parameters

To determine SSC, TA, Trolox equivalent antioxidant capacity (TEAC), and ascorbic acid levels, frozen fruit powder from the same samples (in biological triplicate) used for expression and metabolomic studies were used. For SSC, ∼0.5 g of sample was defrosted to room temperature and the puree deposited onto the lens of a refractometer (Atago PR32, Japan). Titratable acidity was evaluated with an automatic titrator (Titroline easy, Schott North America) as previously described by Zorrilla-Fontanesi et al. (2011). Polyphenols were extracted in 80% (v/v) methanol, and the antioxidant capacity of fruit samples was measured based on the ability of antioxidant molecules to quench the ABTS •+ radical cation [2,2′-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate) Sigma–Aldrich] compared with the antioxidant activity of standard amounts of Trolox. TEAC assays were performed as described ( Pellegrini et al., 1999 Re et al., 1999) using 2 μL of sample and 250 μL of radical reagent. The absorbance at 734 nm was measured after 5 min at 25°C in a spectrophotometer. Results were expressed as μmoles of Trolox equivalents per gram of fresh weight (μmol TE/g FW).

L-Ascorbic acid (L-AA) was measured by HPLC ( Davey et al., 2006 Zorrilla-Fontanesi et al., 2011). In brief, 0.25 g of fruit powder was homogenized in 1 mL cold extraction buffer (metaphosphoric acid 2% [w/v], EDTA 2 mM) and incubated at 0°C for 20 min. The samples were centrifuged at 14,000 rpm for 20 min at 4°C, and the supernatant was filtered (0.45-mm membrane) and transferred to HPLC vials kept on ice. Finally, a 5-mL sample was injected in a Rx-C18 reverse-phase HPLC column (4.6 × 100 mm, 3.5 mM, Agilent Technologies) and detection was performed at 254 nm in a photodiode array detector (G1315D, Agilent Technologies). The mobile phase consisted of a filtered and degassed solution of 0.1 M NaH2PO4, 0.2 mM EDTA pH 3.1 ( Harapanhalli et al., 1993), and the flow rate was 0.7 mL/ min. L-AA content was calculated by comparison with values obtained from a standard curve and were expressed as mg L-AA per 100 g of fresh weight.

Amplicon Sequence Analysis

Amplicon sequencing was performed using cDNA from WF and RF accessions from UF family 17.66. The fruits from each white-skinned and red-skinned accession were collected in the field, and 2-mm-thick fruit skin samples were collected for RNA extraction using a surgical blade. Total RNA was extracted from each sample with a RNeasy Mini Kit (Qiagen, Germany), and cDNA synthesis was performed using LunaScript RT SuperMix Kit (New England Biolabs, USA) following the manufacturer's instructions. For amplicon sequencing, primer sets were developed for the coding region of MYB10 (cv Camarosa, maker-Fvb1-2-snap-gene-157.15-mRNA-1) using IDT's PrimerQuest Software ( Supplemental Data Set 11 ). The PCR products were checked in 3% (w/v) agarose gels and further purified for amplicon sequencing at GENEWIZ (South Plainfield, NJ). The sequencing reads from each WF and RF pool (10 samples per pool) were mapped to the MYB10 gene (maker-Fvb1-2-snap-gene-157.15-mRNA-1) with Geneious v.11.0.5 using default values. The consensus sequences of the MYB10 coding region of white and red strawberry pools were aligned using T-coffee ( Notredame et al., 2000).

Gene and Promoter Cloning and Sequence Homology Analysis

Gene and promoter amplification were performed using MyFi™ DNA Polymerase (Bioline). FvMYB10-gypsy and Fvb1 FIN12 genomic fragments flanking the deleted region were amplified with the 5Prime PCR Extender System (5Prime) using the provided 10× Tuning Buffer following the manufacturer instructions.

PCR products <8 kb were purified with a FavorPrep GEL/PCR Purification Kit (Favorgen). PCR products >8 kb were precipitated (30% [w/v] PEG8000 30mN MgCl2). Purified products were cloned into the pGEM-T Easy Vector Systems (Promega) for Sanger sequencing.

Alinierea secvențelor multiple de MYB10 promoter fragments was performed using the Geneious algorithm (Gap open penalty = 30 Gap extension penalty = 0 50 refinement iterations) and used for homology tree construction (Genetic distance model: Jukes-Cantor Tree build method: Neighbor-Joining Resampling method: Bootstrap 1000 replicates), both in Geneious 7.1.9 ( Kearse et al., 2012). F. vesca MYB10 pro sequence was chosen as outgroup as it belongs to a different species. Promoter sequence alignment and machine-readable tree files are provided as Supplemental Data Sets 12 and 13 .

RNA-Seq Analysis, Differential Gene Expression, and Variant Calling

Total RNA was extracted from two biological replicates of ripe fruits from the seven selected octoploid accessions as described above. Each replicate consisted of a pool of 3 to 5 fruits collected throughout different days at the same time of day (Zeitgeber Time 7). The fruits were immediately frozen in liquid N2 and stored at −80°C until processing. RNA quantity, quality, and integrity were determined based on absorbance ratios at 260 nm/280 and 260 nm/230 nm using a NanoDrop spectrophotometer (ND-1000 V3.5, NanoDrop Technologies, Inc.) and agarose gel electrophoresis and further verified using a 2100 Bioanalyzer (Agilent, Folsom, CA). Sample RIN values ranged from 7.4 to 8.4. Libraries were produced following Illumina´s recommendations at Sistemas Genómicos facilities, where they were sequenced by pair-end sequencing (100 bp × 2) in an Illumina HiSeq 2500 sequencer. Over 200.4 million reads were generated and filtered for high-quality reads by removing reads containing adapters, reads shorter than 50 bp, and reads with Q-value ≤30 using Fastq-mcf from ea-utils ( Aronesty, 2011) with the parameters -q 30 -l 50. The following analyses were performed on processed clean reads.

Read mapping, differential gene expression analysis, and clustering of reads from the seven selected octoploid accessions and the previously described cv Camarosa’ tissues ( Sánchez-Sevilla et al., 2017) were performed using the Tuxedo suit (Hisat2/Cufflinks/CummRbund) following standard procedures ( Trapnell et al., 2012). For the reference genome ( Edger et al., 2019), we used the latest assembled F. ×ananassa genome (Camarosa Genome Assembly v1.0.a1: F_ana_Camarosa_6-28-17.fasta) and annotation (Fxa_v1.2_makerStandard_MakerGenes_woTposases.gff) downloaded from the Genome Database for Rosaceae website (https://www.rosaceae.org/). The overall alignment rate was 90.72%.

Variant calling was performed using the haplotype-based variant detector FreeBayes v1.0.2-16-gd466dde-dirty ( Garrison and Marth, 2012). To identify the different variants at each position in the reference F. ×ananassa genome, alignment BAM files of the different accessions were labeled with samtools. A VCF file was generated with FreeBayes with all parameters set to default. All bioinformatic processes were performed at the Picasso cluster facilities at Servicio de Supercomputación y Bioinformática Málaga (http://scbi.uma.es).

Transient Overexpression by Agro-infiltration of Fruit

Transient expression studies in strawberry fruits were performed as described ( Hoffmann et al., 2006) with minor modifications. Full-length wild-type FvMYB10 and the truncated fvmyb10-2 cDNAs were amplified from total cDNA from ripe fruits of the F2 RV660 × WV596 population RF or WF pools, respectively. Primers FvMYB10-attB1 F and FvMYB10-attB2 R were used to amplify wild-type FvMYB10, and FvMYB10-attB1 F and ccm29 were used to amplify fvmyb10-2 ( Supplemental Data Set 11 ). Primer ccm29 is complementary to a region of the retrotransposon 45 to 70 bp downstream of the insertion point, which includes the first stop codon generated after the insertion. Each gene version was cloned into the Gateway transfer vector pDONR221 and then into the binary vector pK7WG2D under the control of the cauliflower mosaic virus 35S promoter (Gateway BP and LR Clonase II Enzyme mix, Invitrogen). The resulting plasmids were introduced into Agrobacterium strain AGL0 following the protocol of Höfgen and Willmitzer (1988). Immature fruits in the late green/early white stage were used for agro-infiltration using 1 mL suspension of each culture in combination (1:1) with a suspension of Agrobacterium LBA4404 with the p19 suppressor of gene silencing ( Voinnet et al., 2003). Agro-infiltrated fruits were labeled and left to ripen in planta for ∼7 to 10 d.

HRM Marker Development and Marker Data Analysis

The primer set targeting the 8-bp mutation was designed using IDT's PrimerQuest Software and ordered from IDT (San Jose, California Supplemental Data Set 11 ). PCR amplification was performed in a 5 μL reaction containing 0.5 μM of each primer set, 2× AccuStart TM II PCR ToughMix (Quantabio, Beverly, Massachusetts ), 1× LC Green Plus HRM dye (BioFire, Salt Lake City, Utah), and 0.5 μL of DNA. The PCR conditions were as follows: an initial denaturation at 95°C for 5 min 45 cycles of denaturation at 95°C for 10 s, annealing at 62°C for 10 s, and extension at 72°C for 20 s. After PCR amplification, the samples were heated to 95°C for 1 min and cooled to 40°C for 1 min. Melting curves were obtained by melting over the desired range (60° to 95°C) at a rate of 50 acquisitions per 1°C. The HRM assay was performed with the LightCycler 480 System II (Roche Life Science, Germany). The HRM data were analyzed using Melt Curve Genotyping and Gene Scanning Software (Roche Life Science, Germany). Analysis of HRM variants was based on differences in the shapes of the melting curves and Tm values.

SNP Genotyping using KASP

An SNP in MYB10-2 at position −20 from the initial ATG associated with white/red flesh color in the sequenced accessions was targeted for the KASP assay. To produce a subgenome-specific assay, a combination of four primers was used in each reaction: two common forward primers (ccm90 and ccm91) to account for a background-specific G/A SNP, and two allele-specific primers (ccm92 and ccm93), each carrying the standard FAM or HEX dye tails and the targeted SNP at the 3′ end. A single common primer is generally used for standard KASP assays, but the high degree of polymorphism in the targeted region made it necessary to include an extra common forward primer to account for a different, background-associated G/A SNP not linked to the white-fleshed trait. Reaction volumes of 5 μL for 384-well plates were used 2.5 μL of MasterMix, 0.07 μL of assay/primer mix, and 2.5 μL of DNA (12.5 ng total) were used for genotyping. The final primer concentrations in the reaction mix were 210 nM for ccm90 and ccm91 150 nM for ccm92 and 190 nM for ccm93. PCR was conducted in a BioRad CFX-384 instrument using the following protocol: An initial denaturation step at 94°C for 15 min, 12 touchdown cycles (94°C for 20 s, 65°C for 80 s, dropping 0.6°C per cycle), 29 cycles (94°C for 20 s, 58°C for 80 s), and a final recycling for 2 cycles (94°C for 20 s, 60°C for 80 s). BioRad software was used to estimate the final results.

Accession Numbers

F. vesca FIN12 accession sequencing data are stored at National Center for Biotechnology Information Short Read Archive (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra) under accession number PRJNA655237.

The raw reads data from (1) Illumina high-throughput sequencing of RF and WF DNA pools from F2 lines of the F. vesca RV660 × WV596 population and (2) RNA-seq from ripe fruits of white and red octoploid accessions were stored at the Sequence Read Archive (SRA) of the European Nucleotide Archive (ENA) under project reference number PRJEB38128. In the same project, Sanger sequences were stored under the following specific codes: (1) fvmyb10-3 mutant alleles sequences from SE100, GER1, and GER2: LR862245, LR862246, and LR862247 (2) MYB10 promoter sequences from F. chiloensis ssp. chiloensis FC157 MYB10-1 pro/MYB10-3B pro, MYB10-2 pro, și MYB10-3A pro (LR862237-LR862239), F. chiloensis ssp. lucida USA2 MYB10-3A pro, MYB10-1 pro/MYB10-3B pro, și MYB10-2 pro (LR862240-LR862242), Fragaria × ananassa cv Senga Sengana MYB10-3A pro și MYB10-1 pro/MYB10-3B pro (LR862243- LR862244) and (3) The FvMYB10-gypsy LTR-TE sequence from fvmyb10-2: LR8622681.

Date suplimentare

Supplemental Figure 1. . The LTR-TE insertion in FvMYB10 cosegregates with the white fruit phenotype in the entire RV660xWF596 population.

Supplemental Figure 2. . TEAC, soluble solid content (SSC), titratable acidity (TA), and L-ascorbic acid (L-AA) content in RF and WF F2 pools of the RV660 x WV596 population.

Supplemental Figure 3. . F. vesca accession FIN12 has a large deletion affecting an ∼100 kb region in Fvb1 that results in the loss of seven predicted genes including FvMYB10 (FvH4_1g22020).

Supplemental Figure 4. . Fruit skin color in UF population 17.66 (FL 13.65-160 × FL 14.29-1).

Supplemental Figure 5. . Fruit flesh and skin color phenotypes in the Hansabred SS×FcL population.

Supplemental Figure 6. . Senga Sengana x F. chiloensis ssp. lucida linkage map and comparison to the physical positions in the F. vesca reference genome.

Supplemental Figure 7. . Expression of cv Camarosa FaMYB10 homoeologs in different tissues and during fruit ripening.

Supplemental Figure 8. . Sequence alignment of WT and mutant MYB10-2 in UF breeding population 17.66.

Supplemental Figure 9. . Alignment of the MYB10 upstream region showing the SNP targeted for KASP genotyping.

Supplemental Figure 10. . Fruit color scale used to phenotype octoploid accessions.

Supplemental Data Set 1 .. List of significant SNPs and INDELs in the RV660 × WV596 population.

Supplemental Data Set 3 .. List of Fragaria ssp. included in this study and description of mutations detected in MYB10.

Supplemental Data Set 4 .. QTLs detected for fruit color traits in the cv Senga Sengana × Fragaria chiloensis ssp. lucida F2 population by Kruskal-Wallis (KW) and restricted multiple QTL mapping (rMQM) analysis.

Supplemental Data Set 5 .. Polymorphisms at MYB10 homoeologs from F. chiloensis accessions and cv Senga Sengana vs. the cv Camarosa reference genome.

Supplemental Data Set 6 .. Expression of anthocyanin pathway genes in cv Senga Sengana and white-fleshed F. chiloensis accessions.

Supplemental Data Set 7 .. Predicted putative cis-elements specific to cv Camarosa FaMYB10-2 pro.

Supplemental Data Set 8 .. Predicted putative cis-elements specific to cv Camarosa FaMYB10-2 pro potentially significant in the context of fruit ripening and anthocyanin production.

Supplemental Data Set 9 .. Putative cis-elements predicted in FvMYB10 pro overlapping with those exclusively predicted in cv Camarosa FaMYB10-2 pro.

Supplemental Data Set 10 .. Phenotypes and WS_CID_1 marker genotypes of UF breeding population 17.66 (FL 13.65-160 × FL 14.29-1).

Supplemental Data Set 12 .. Sequence alignment file in fasta format of MYB10 pro variants.


Priveste filmarea: Cum ingrijim corect Ficusul (Februarie 2023).