Informație

Care proteine ​​sunt cele mai sensibile la câmpurile electrice?


Multe proteine ​​au sarcini ionice care se pot atrage reciproc (de exemplu, formarea punților de sare) sau se pot respinge reciproc. Pe de altă parte, proteinele sunt în mare parte scufundate în apă care ecranează majoritatea sarcinilor electrice ale proteinelor. Motivul este că apa este un dielectric, moleculele de H2O pot fi polarizate cu ușurință. Deci forțele electrostatice sunt reduse în soluție apoasă.

Acum întreb ce proteine ​​pot fi ușor afectate atunci când se aplică un câmp electric? Asta înseamnă ce proteine ​​își vor schimba substanțial conformația chiar și atunci când sunt aplicate câmpuri electrice slabe?

Pot unele proteine ​​scufundate în apă să fie dependente și de câmpurile electrice externe?


Există diferite proteine ​​sensibile la modificările câmpului electric. Mai precis, ele sunt activate prin modificări ale tensiunii (în jurul proteinei) și scufundate în apă, deoarece toate celulele sunt compuse în principal dintr-o soluție apoasă. Aveți dreptate că majoritatea sarcinilor din lanțurile laterale ale aminoacizilor proteinelor sunt „mascate” de caracterul dipol al moleculelor de apă, dar potențialul electrochimic al celulei se datorează în primul rând ionilor și nu interacțiunii dintre lanțurile laterale din o proteină. Cu toate acestea, este important de menționat că în cadrul acestor proteine ​​sensibile la modificările din câmpul electrochimic, există domenii care conțin aminoacizi încărcați (adică neacoperiți de apă), foarte importante pentru a putea „sesiza” modificările tensiunilor.

Puteți verifica unele dintre canalele ionice sensibile la tensiune, care participă la diferite căi celulare, inclusiv generarea și transmiterea potențialului de acțiune în neuroni:

Wikipedia are o intrare bună despre ele.


După cum ați menționat, apa este un dielectric și din cauza asta și a prezenței ionilor în soluție, forțele electrostatice au o rază foarte mică în interiorul unei celule. Dacă aplicați o diferență de potențial (tensiune) în soluție, veți genera un câmp electric constant între cei doi electrozi. Proteinele vor răspunde la acest câmp electric deplasându-se spre anod sau catod în funcție de sarcina proteinei. Aceasta este ceea ce știm ca electroforeză (rețineți că pentru electroforeza proteinelor aveți nevoie de obicei de zeci până la sute de volți)

Acum, când aveți aceeași diferență de tensiune, dar există un izolator electric în mijloc, cea mai mare parte a câmpului electric va fi concentrat în materialul izolator.

Acesta este ceea ce se întâmplă în membrana celulară care izolează diferența mică de tensiune dintre interiorul și exteriorul celulei (-40 până la -90 mV în funcție de celulă). Această mică diferență de tensiune generează un câmp electric imens cu membrana care acum poate fi detectat de reziduurile încărcate de proteine ​​din membrană, cum ar fi argininele din senzorul de tensiune al unui canal de potasiu. Câmpurile electrice detectate de aceste canale sunt de ordinul 10^8 până la 10^9 V/m.


5.5: Electroforeza pe gel a proteinelor

  • Contribuție de Michael Blaber
  • Profesor (științe biomedicale) la Universitatea de Stat din Florida

Electroforeza pe gel este utilizată pentru a caracteriza una dintre cele mai de bază proprietăți - masa moleculara - atat a polinucleotidelor cat si a polipeptidelor. Aici ne vom concentra exclusiv pe electroforeza pe gel a proteinelor

Electroforeza pe gel poate fi utilizată pentru a determina:

  • cel puritate a unei probe de proteine
  • eterogenitate și gradul de degradare a unei probe de proteine
  • compoziția subunității a unei probe de proteine

Cum functioneazã?

Principiul de bază al electroforezei este proprietatea de migrare a speciilor încărcate într-un câmp electric. Astfel, este comportamentul simplu al sarcinilor opuse care atrage. Un câmp electric este stabilit peste electrozii unei surse de alimentare, iar ionii încărcați se mișcă în acest câmp electric. Rețineți că într-un astfel de aparat, cuvântul „ANOD” se referă la electrodul încărcat pozitiv (ANODUL atrage ANIONI) și cuvântul „CATOD” se referă la electrodul încărcat negativ (CATODUL atrage CATII). Termenii catod și anod sunt în concordanță cu definițiile lor de reacție redox reducerea are loc ulterior la catod și oxidarea are loc la anod:

Figura 5.5.1:Anod și catod

Atenție: citiți următoarea notă doar dacă sunteți curios despre baterii și etichetarea electrozilor, în caz contrar, nu vă deranjați (poate fi doar confuz).

Chimia redox din sursa de alimentare externă conduce reacția redox la electrozi. Rețineți că electronii de la anod merg la borna „+” a bateriei. Reducerea la acest electrod al bateriei trebuie să aibă loc și conduce oxidarea la anodul electrozilor externi. Dacă acest terminal al bateriei este redus, atunci trebuie să fie catodul în reacția redox din cadrul bateriei. Astfel, bateriile au catodul etichetat ca „+” și anodul etichetat ca „-”. Mi-a luat ore întregi să-mi dau seama.

Proteinele sunt compuse din cei 20 de aminoacizi comuni, care includ atât lanțuri laterale încărcate negativ (adică acide) (de exemplu, acid aspartic, acid glutamic) cât și încărcate pozitiv (adică bazice) (de exemplu, histidină, lizină și arginină). Astfel, proteinele pot fi încărcate și vor migra într-un câmp electric.

În acest moment, există câteva lucruri de luat în considerare:

1) Orice astfel de separare este un proces de neechilibru. Prin aceasta, înțelegem că dacă lăsăm procesul să continue până când este îndeplinită o condiție de echilibru, toți anionii vor fi pe un electrod și toți cationii vor fi pe celălalt. Ar fi mai bine să opri procesul de separare la un moment intermediar pentru a permite realizarea separării:

Figura 5.5.2:Proces de separare

2) Cealaltă problemă este că odată ce câmpul electric este oprit, difuzia va face ca ionii separați să se miște (adică vom pierde separarea pe care am încercat să o realizăm). Pentru a rezolva această problemă, separarea nu se realizează în soluție, ci în cadrul unei matrice (adică o plasă moleculară sau o rețea). Matricea oferă a componenta de frecare care rezistă difuziei. În plus, frecarea matricei este un factor important în rata de migrare a ionilor.

3) De asemenea, rețineți că separarea se realizează prin aplicarea inițială a probei într-o zonă (bandă) îngustă. Dacă proba este inițial dispersată, deși ionii se vor mișca, aceștia nu vor fi separați bine.

Factorii care influențează rata de migrare a electroforezei (Rf)

Trei factori afectează rata migrației:

· Puterea câmpului electric, E (direct proporțional cu rata de migrare)

· Sarcină pe specia ionică, q (direct proporțională cu rata de migrare)

· Coeficientul de frecare al matricei suport, f (invers proporțional cu rata de migrare)

Acești factori pot fi variați în felul următor:

· Puterea câmpului este o funcție a Voltaj a sursei de alimentare. Astfel, putem varia tensiunea direct. Într-o problemă conexă, tensiunea este proporțională cu rezistența între electrozi. Curentul intră în joc și aici, dar pe scurt, este dificil să se obțină o tensiune înaltă pe electrozi dacă rezistența este scăzută. Rezistența unei soluții este invers proporțională cu puterea ionică (adică concentrația de ioni). Astfel, cu concentrații mari de sare, rezistența este scăzută, este dificil să se obțină tensiune înaltă, iar rata de migrare va scădea.

· Sarcina unei molecule ionice este o funcție a pI a moleculei și pH-ul soluției

Dacă pI > pH molecula este cationică
(migrează spre catod)

Dacă pI < pH molecula este anionică
(migrează spre anod)

Dacă pI = pH molecula este neutră
(fără migrare în câmp electric)

Prin urmare, putem modifica rata de migrare (și eventual direcția de migrare) prin modificarea pH-ului soluției

· Coeficientul de frecare al matricei poate fi modificat. Matricea este de obicei o rețea polimerică (vezi mai jos), denumită a gel, iar coeficientul de frecare poate fi crescut prin creșterea concentrației de polimer


Opțiuni de acces

Obțineți acces complet la jurnal timp de 1 an

Toate preturile sunt preturi NET.
TVA-ul va fi adăugat mai târziu la finalizarea comenzii.
Calculul taxelor va fi finalizat în timpul plății.

Obțineți acces limitat în timp sau complet la articole pe ReadCube.

Toate preturile sunt preturi NET.


Blocuri de construcție ale proteinelor

Aminoacizii sunt elementele de bază ale proteinelor. În total, există 20 de aminoacizi diferiți găsiți în natură. Aminoacizii se pot lega împreună într-o mare varietate de moduri pentru a crea proteine ​​diferite.

Structura chimică a aminoacizilor este cheia pentru care proteinele au devenit fundamentul vieții. Un aminoacid constă dintr-o grupă carboxil (structură chimică -COOH), o grupare amină (-NH₂) și o catenă laterală formată în principal din carbon și hidrogen.

Lanțul lateral este adesea denumit grupul R. Diferențele în grupul R sunt ceea ce face ca cei 20 de aminoacizi să fie diferiți unul de celălalt.

În funcție de structura grupului R, un aminoacid poate fi solubil în apă (polar), insolubil în apă (nepolar) sau poate conține o sarcină pozitivă sau negativă. Aceste caracteristici afectează, la rândul lor, modul în care se comportă aminoacizii pe măsură ce se leagă și influențează forma generală și funcția unei proteine.

Toți cei 20 de aminoacizi sunt necesari pentru o sănătate bună. Dacă un organism are un conținut scăzut de unul dintre cei 20 de aminoacizi, anumite proteine ​​nu vor putea fi construite, iar pierderea funcțiilor lor va cauza probleme de sănătate pentru organism.

Unii aminoacizi pot fi creați de organism folosind alte molecule, în timp ce alți aminoacizi trebuie să provină din alimente. Aminoacizii care trebuie consumați sunt cunoscuți ca „aminoacizi esențiali” deoarece sunt o parte esențială a unei diete sănătoase. Aminoacizii care pot fi fabricați de corpul nostru sunt cunoscuți sub denumirea de „aminoacizi neesențiali”.


Generarea câmpului electric și organul electric

În introducerea sa în secțiunea dedicată discuției despre organul specializat care generează câmpuri electrice slabe, Michael Markham, de la Universitatea din Oklahoma, SUA, descrie modul în care Hans Lissmann a fondat studiul peștilor slab electrici în anii 1950 (p. 2451 ). Nu numai că Lissmann a demonstrat asta Gymnarchus niloticus produc câmpuri electrice slabe, dar, de asemenea, a arătat că peștii își simt mediul înconjurător și comunică prin intermediul Câmpurile. Trecând în revistă lucrările timpurii ale lui M. V. Bennett privind fiziologia organului electric, Markham continuă să descrie modul în care câmpurile electrice slabe sunt produse de descărcarea sincronizată a grupurilor mari de electrocite. Adăugând că descărcarea electrocitelor este coordonată în moduri diferite pentru a produce cele două tipuri de câmp emise de pești – trenuri regulate de impulsuri electrice sau un câmp „sinusoidal” continuu – Markham continuă apoi explicând modul în care descărcarea este reglată hormonal, rezultând în dimorfismul sexual în câmpurile electrice și controlat la nivel molecular prin modificarea producției de canale ionice în organul electric pentru a modifica forma de undă a câmpului.

În următoarea contribuție pe tema generării organelor electrice și a câmpului electric, Vielka Salazar, Rüdiger Krahe și John Lewis discută despre energia producției de câmp electric slab (p. 2459). Începând revizuirea lor cu faptul uimitor că activitatea creierului poate reprezenta până la 20% din rata metabolică de repaus la unele animale și că acest cost ridicat este suportat de menținerea activității electrice, trio-ul recapitulează apoi circuitele neuronale care reglează organul electric. deversare. În continuare, ei revizuiesc calculele cantității de energie care este necesară pentru a menține câmpurile electrice care apar din diferite aranjamente ale sarcinii electrice. Pe baza acestor calcule, Salazar și conducătorul ei de doctorat Philip Stoddard au estimat în 2008 că bărbatul Brachyhipopomus cheltuiesc 11–22% din bugetul lor energetic pentru producția de câmp electric. Având în vedere diversitatea speciilor de pești electrici și câmpurile electrice pe care le produc, echipa concluzionează sugerând că peștii electrici ne-ar putea învăța cum ar putea influența constrângerile energetice evoluția diversității semnalului.

Robert Güth, Matthew Pinch și Graciela Unguez abordează apoi întrebarea intrigantă cu privire la cât de slab s-au adaptat mușchii peștii electrici pentru a produce un țesut care nu se mai contractă, ci produce un câmp electric măsurabil (p. 2469). Deoarece mușchiul convențional este intrinsec versatil (plastic), efectuând o mare varietate de funcții diferite în mod natural, trio-ul explică că caracteristicile neobișnuite ale organului electric derivat din mușchi le permit să răspundă la întrebări fundamentale despre mecanismele moleculare care reglează plasticitatea musculară. Concentrându-se pe Sternopygus macrurus, Unguez și studenții ei descriu modul în care electrocitele derivate din mușchi produc multe dintre proteinele esențiale pentru contracția musculară, dar le lipsește structura sarcomerului care este fundamentală pentru contracția musculară. Echipa subliniază, de asemenea, că multe dintre mecanismele moleculare care guvernează dezvoltarea și întreținerea mușchilor sunt conservate în organul electric, deși unele dintre genele care codifică componentele esențiale ale sarcomerului nu sunt traduse în proteine ​​funcționale (în ciuda faptului că sunt transcrise în ARNm). Acest lucru arată că există diferențe fundamentale între reglarea expresiei proteinelor în celulele musculare convenționale și electrocite. Echipa adaugă că această suprimare a producției de proteine ​​musculare cheie în electrocite este influențată de activarea electrică de înaltă frecvență a țesutului și concluzionează: „Noi credem că aceste studii în S. macrurus va oferi, de asemenea, perspective importante asupra proceselor moleculare multiple care reglează expresia genelor musculare la alte vertebrate.

De parcă capacitatea de a converti mușchii într-un organ care generează câmpuri electrice nu ar fi suficient de remarcabilă, Unguez continuă – într-o singură publicație de autor – descrie modul în care peștii adulți slab electrici pot regenera atât organul electric, cât și mușchiul după o parte a cozii. a fost pierdut (p. 2478 ). Deși regenerarea țesuturilor este larg răspândită în rândul peștilor osoși adulți, puterile lor de restaurare sunt adesea limitate. Cu toate acestea, spune Unguez, „Unele gimnotiforme pot înlocui toate țesuturile pierdute după amputații repetate ale cozii, sugerând o capacitate de regenerare inepuizabilă la adult.” Și tocmai această capacitate face ca unele specii de pești electrici să fie ideale pentru a ne învăța despre regenerarea țesuturilor. După ce am explicat că țesutul se poate regenera prin intermediul două mecanisme – morfalaxia, în care țesutul este reorganizat în timpul regenerării, sau epimorfoza, în care celulele se înmulțesc – Unguez descrie modul în care celulele stem, care au potențialul de a se împărți și de a se dezvolta în orice țesut, apar în mod natural în asociere cu fibrele musculare și electrocitele. Ea revizuiește, de asemenea, modul în care s-a demonstrat că aceste celule stem specifice refac țesutul muscular și electrocitar pierdut prin epimorfoză în timpul regenerării cozii.


Cuprins

Termenii sunt adesea folosiți interschimbabil. Atunci când se intenționează o distincție, totuși, aceasta se bazează pe dacă se pune accentul pe aplicarea ideilor biologice sau pe studierea biologiei cu nanotehnologie. Bionanotehnologia se referă în general la studiul modului în care obiectivele nanotehnologiei pot fi ghidate prin studierea modului în care funcționează „mașinile” biologice și adaptarea acestor motive biologice pentru a îmbunătăți nanotehnologiile existente sau pentru a crea altele noi. [5] [6] Nanobiotehnologia, pe de altă parte, se referă la modalitățile prin care nanotehnologia este utilizată pentru a crea dispozitive pentru a studia sistemele biologice. [7]

Cu alte cuvinte, nanobiotehnologia este în esență biotehnologie miniaturizată, în timp ce bionanotehnologia este o aplicație specifică a nanotehnologiei. De exemplu, nanotehnologia ADN-ului sau ingineria celulară ar fi clasificată ca bionanotehnologie deoarece implică lucrul cu biomolecule la scară nanometrică. În schimb, multe tehnologii medicale noi care implică nanoparticule ca sisteme de livrare sau ca senzori ar fi exemple de nanobiotehnologie, deoarece implică utilizarea nanotehnologiei pentru a avansa obiectivele biologiei.

Definițiile enumerate mai sus vor fi utilizate ori de câte ori se face o distincție între nanobio și bionano în acest articol. Cu toate acestea, având în vedere suprapunerea termenilor în limbajul modern, este posibil ca tehnologiile individuale să fie nevoie să fie evaluate pentru a determina care termen este mai potrivit. Ca atare, ele sunt cel mai bine discutate în paralel.

Majoritatea conceptelor științifice din bionanotehnologie sunt derivate din alte domenii. Principiile biochimice care sunt folosite pentru a înțelege proprietățile materiale ale sistemelor biologice sunt esențiale în bionanotehnologie, deoarece aceleași principii urmează să fie utilizate pentru a crea noi tehnologii. Proprietățile materialelor și aplicațiile studiate în bionanoștiință includ proprietăți mecanice (de exemplu, deformare, aderență, defecțiune), electrice/electronice (de exemplu, stimulare electromecanică, condensatori, stocare de energie/baterii), optice (de exemplu, absorbție, luminiscență, fotochimie), termice (de exemplu, termomutabilitatea, management termic), biologic (de exemplu, modul în care celulele interacționează cu nanomaterialele, defecte/defecte moleculare, biosensing, mecanisme biologice cum ar fi mecanosenzația), nanoștiința bolii (de exemplu, boală genetică, cancer, insuficiență de organ/țesut), precum și de calcul (de exemplu, ADN informatică) și agricultură (livrarea țintă de pesticide, hormoni și îngrășăminte. [8] [9] [10] [11] Impactul bionanostiintei, realizat prin analize structurale și mecanice ale proceselor biologice la scară nanometrică, este traducerea lor în procese sintetice și tehnologice. aplicații prin nanotehnologie.

Nanobiotehnologia își ia majoritatea elementelor fundamentale din nanotehnologie. [ clarificarea necesară ] Majoritatea dispozitivelor concepute pentru utilizare nano-biotehnologică se bazează direct pe alte nanotehnologii existente. [ citare necesară ] Nanobiotehnologia este adesea folosită pentru a descrie activitățile multidisciplinare care se suprapun asociate cu biosenzorii, în special acolo unde fotonica, chimia, biologia, biofizica, nanomedicina și inginerie converg. Măsurarea în biologie folosind tehnici de ghidare de undă, cum ar fi interferometria cu polarizare dublă, este un alt exemplu.

Aplicațiile bionanotehnologiei sunt extrem de răspândite. În măsura în care distincția este valabilă, nanobiotehnologia este mult mai comună, deoarece pur și simplu oferă mai multe instrumente pentru studiul biologiei. Bionanotehnologia, pe de altă parte, promite să recreeze mecanismele și căile biologice într-o formă care este utilă în alte moduri.

Editare nanomedicină

Nanomedicina este un domeniu al științei medicale ale cărui aplicații cresc din ce în ce mai mult datorită nanoroboților și mașinilor biologice, care constituie un instrument foarte util pentru dezvoltarea acestui domeniu de cunoaștere. În ultimii ani, cercetătorii au făcut multe îmbunătățiri în diferitele dispozitive și sisteme necesare pentru a dezvolta nanoroboți.Aceasta presupune o nouă modalitate de a trata și trata boli precum cancerul datorită nanoroboților, efectele secundare ale chimioterapiei au fost controlate, reduse și chiar eliminate, așa că peste câțiva ani, pacienților cu cancer li se va oferi o alternativă pentru tratarea acestei boli în loc de chimioterapie [ citare necesară ] , care provoacă efecte secundare precum căderea părului, oboseala sau greața uciderea nu numai a celulelor canceroase, ci și a celor sănătoase. La nivel clinic, tratamentul cancerului cu nanomedicina va consta in furnizarea de nanoroboti pacientului printr-o injectie care va cauta celulele canceroase in timp ce le va lasa pe cele sanatoase neatinse. Pacienții care vor fi tratați prin nanomedicină nu vor observa prezența acestor nanomașini în interiorul lor, singurul lucru care va fi remarcat este îmbunătățirea progresivă a sănătății lor. Nanobiotehnologia este destul de importantă pentru formularea medicamentelor. Ajută foarte mult și la fabricarea vaccinurilor. [ clarificarea necesară ]

Nanobiotehnologie Edit

Nanobiotehnologia (uneori denumită nanobiologie) este cel mai bine descrisă ca ajutând medicina modernă să progreseze de la tratarea simptomelor la generarea de cure și regenerarea țesuturilor biologice. Trei pacienți americani au primit vezici întregi de cultură cu ajutorul medicilor care folosesc tehnici de nanobiologie în practica lor. De asemenea, s-a demonstrat în studiile pe animale că un uter poate fi crescut în afara corpului și apoi plasat în corp pentru a produce un copil. Tratamentele cu celule stem au fost folosite pentru a repara bolile care se găsesc în inima umană și sunt în studii clinice în Statele Unite. Există, de asemenea, finanțare pentru cercetarea pentru a permite oamenilor să aibă membre noi fără a fi nevoie să recurgă la proteză. Proteinele artificiale ar putea deveni disponibile pentru fabricare fără a fi nevoie de substanțe chimice dure și mașini scumpe. S-a presupus chiar că, până în anul 2055, computerele ar putea fi făcute din substanțe biochimice și săruri organice. [12]

Un alt exemplu de cercetare nanobiotehnologică actuală implică nanosferele acoperite cu polimeri fluorescenți. Cercetătorii caută să proiecteze polimeri a căror fluorescență este stinsă atunci când întâlnesc molecule specifice. Diferiți polimeri ar detecta diferiți metaboliți. Sferele acoperite cu polimeri ar putea deveni parte a noilor teste biologice, iar tehnologia ar putea duce într-o zi la particule care ar putea fi introduse în corpul uman pentru a urmări metaboliții asociați cu tumori și alte probleme de sănătate. Un alt exemplu, dintr-o perspectivă diferită, ar fi evaluarea și terapia la nivel nanoscopic, adică tratamentul Nanobacteriilor (dimensiuni 25-200 nm) așa cum se face de către NanoBiotech Pharma.

În timp ce nanobiologia este la început, există o mulțime de metode promițătoare care se vor baza pe nanobiologie în viitor. Sistemele biologice sunt în mod inerent nano la scară. Nanoștiința trebuie să fuzioneze cu biologia pentru a furniza biomacromolecule și mașini moleculare care sunt similare cu natura. Controlul și imitarea dispozitivelor și proceselor care sunt construite din molecule este o provocare extraordinară de înfruntat pentru disciplinele convergente ale nanobiotehnologiei. [13] Toate ființele vii, inclusiv oamenii, pot fi considerate a fi nanofundări. Evoluția naturală a optimizat forma „naturală” a nanobiologiei de-a lungul a milioane de ani. În secolul 21, oamenii au dezvoltat tehnologia pentru a accesa în mod artificial nanobiologie. Acest proces este cel mai bine descris ca „fuziune organică cu sintetică”. Coloniile de neuroni vii pot trăi împreună pe un dispozitiv cu biocip, conform cercetărilor dr. Gunther Gross de la Universitatea din North Texas. Nanotuburile cu auto-asamblare au capacitatea de a fi utilizate ca sistem structural. Acestea ar fi compuse împreună cu rodopsine care ar facilita procesul de calcul optic și ar ajuta la stocarea materialelor biologice. ADN-ul (ca software pentru toate ființele vii) poate fi folosit ca sistem proteomic structural - o componentă logică pentru calculul molecular. Ned Seeman - un cercetător la Universitatea din New York - împreună cu alți cercetători cercetează în prezent concepte care sunt similare între ele. [14]

Bionanotehnologie Edit

Nanotehnologia ADN-ului este un exemplu important de bionanotehnologie. [15] Utilizarea proprietăților inerente ale acizilor nucleici precum ADN-ul pentru a crea materiale utile este un domeniu promițător al cercetării moderne. Un alt domeniu important de cercetare implică profitarea proprietăților membranei pentru a genera membrane sintetice. Proteinele care se auto-asamblează pentru a genera materiale funcționale ar putea fi utilizate ca o abordare nouă pentru producția la scară largă de nanomateriale programabile. Un exemplu este dezvoltarea amiloizilor găsiți în biofilmele bacteriene ca nanomateriale proiectate care pot fi programate genetic pentru a avea proprietăți diferite. [16] Studiile de pliere a proteinelor oferă o a treia cale importantă de cercetare, dar una care a fost în mare măsură inhibată de incapacitatea noastră de a prezice plierea proteinelor cu un grad suficient de mare de acuratețe. Cu toate acestea, având în vedere nenumăratele utilizări pe care sistemele biologice le au pentru proteine, cercetările pentru înțelegerea plierii proteinelor sunt de mare importanță și s-ar putea dovedi fructuoasă pentru bionanotehnologie în viitor.

Nanotehnologia lipidelor este un alt domeniu major de cercetare în bionanotehnologie, în care proprietățile fizico-chimice ale lipidelor, cum ar fi antifouling și auto-asamblarea lor, sunt exploatate pentru a construi nanodispozitive cu aplicații în medicină și inginerie. [17] Abordările din nanotehnologia lipidelor pot fi, de asemenea, utilizate pentru a dezvolta metode de emulsie de ultimă generație pentru a maximiza atât absorbția nutrienților liposolubili, cât și capacitatea de a le încorpora în băuturile populare.

Agricultura Edit

În industria agriculturii, nanoparticulele de inginerie au servit ca nano purtători, conținând erbicide, substanțe chimice sau gene, care vizează anumite părți ale plantelor pentru a-și elibera conținutul. [18] [19] Anterior, s-a raportat că nanocapsulele care conțin erbicide penetrează eficient prin cuticule și țesuturi, permițând eliberarea lentă și constantă a substanțelor active. De asemenea, altă literatură descrie că eliberarea lentă nano-încapsulată a îngrășămintelor a devenit, de asemenea, o tendință de a economisi consumul de îngrășăminte și de a minimiza poluarea mediului prin agricultura de precizie. Acestea sunt doar câteva exemple din numeroase lucrări de cercetare care ar putea deschide oportunități interesante pentru aplicarea nanobiotehnologiei în agricultură. De asemenea, aplicarea acestui tip de nanoparticule de inginerie la plante ar trebui să fie considerată nivelul de amiabilitate înainte de a fi folosită în practicile agricole. Pe baza unui studiu amănunțit din literatură, s-a înțeles că există doar informații autentice disponibile limitate pentru a explica consecințele biologice ale nanoparticulelor modificate asupra plantelor tratate. Anumite rapoarte subliniază fitotoxicitatea de diferite origini a nanoparticulelor modificate pentru plantă, cauzată de subiectul concentrațiilor și dimensiunilor. În același timp, totuși, au fost raportate un număr egal de studii cu un rezultat pozitiv al nanoparticulelor, care facilitează creșterea promovând natura pentru tratarea plantelor. [20] În special, în comparație cu alte nanoparticule, aplicațiile bazate pe nanoparticule de argint și aur au obținut rezultate benefice pe diferite specii de plante cu o toxicitate mai mică și/sau fără toxicitate. [21] [22] Frunzele de sparanghel tratate cu nanoparticule de argint (AgNPs) au arătat conținutul crescut de ascorbat și clorofilă. În mod similar, fasolea și porumbul tratate cu AgNP au crescut lungimea lăstarilor și rădăcinii, suprafața frunzei, clorofila, carbohidrații și conținutul de proteine ​​raportate mai devreme. [23] Nanoparticulele de aur au fost folosite pentru a induce creșterea și producția de semințe la Brassica juncea. [24]


Care proteine ​​sunt cele mai sensibile la câmpurile electrice? - Biologie

Proteinele sunt polimeri ai aminoacizilor. Douăzeci de tipuri diferite de aminoacizi apar în mod natural în proteine. Proteinele diferă între ele în funcție de tipul, numărul și secvența de aminoacizi care alcătuiesc coloana vertebrală polipeptidică. Drept urmare, au structuri moleculare, atribute nutriționale și proprietăți fizico-chimice diferite. Proteinele sunt constituenți importanți ai alimentelor din mai multe motive. Sunt o sursă majoră de energie, precum și conțin aminoacizi esențiali, cum ar fi lizina, triptofanul, metionina, leucina, izoleucina și valina, care sunt esențiale pentru sănătatea umană, dar pe care organismul nu le poate sintetiza. Proteinele sunt, de asemenea, componentele structurale majore ale multor alimente naturale, determinând adesea textura lor generală, de exemplu, frăgezimea produselor din carne sau pește. Proteinele izolate sunt adesea folosite în alimente ca ingrediente datorită proprietăților lor funcționale unice, adică capacității lor de a oferi aspectul, textura sau stabilitatea dorite. De obicei, proteinele sunt utilizate ca agenți de gelifiere, emulgatori, agenți de spumare și agenți de îngroșare. Multe proteine ​​alimentare sunt enzime care sunt capabile să mărească viteza anumitor reacții biochimice. Aceste reacții pot avea fie un efect favorabil, fie un efect negativ asupra proprietăților generale ale alimentelor. Analiștii din alimente sunt interesați să cunoască concentrația totală, tipul, structura moleculară și proprietățile funcționale ale proteinelor din alimente.

6.2. Determinarea concentrației totale de proteine

Metoda Kjeldahl a fost dezvoltată în 1883 de către un producător de bere numit Johann Kjeldahl. Un aliment este digerat cu un acid puternic, astfel încât să elibereze azot care poate fi determinat printr-o tehnică adecvată de titrare. Cantitatea de proteină prezentă este apoi calculată din concentrația de azot din alimente. Aceeași abordare de bază este folosită și astăzi, deși au fost aduse o serie de îmbunătățiri pentru a accelera procesul și pentru a obține măsurători mai precise. Este de obicei considerată a fi metoda standard de determinare a concentrației de proteine. Deoarece metoda Kjeldahl nu măsoară conținutul de proteine ​​în mod direct, este necesar un factor de conversie (F) pentru a converti concentrația de azot măsurată într-o concentrație de proteine. Un factor de conversie de 6,25 (echivalent cu 0,16 g azot per gram de proteină) este utilizat pentru multe aplicații, cu toate acestea, aceasta este doar o valoare medie și fiecare proteină are un factor de conversie diferit în funcție de compoziția sa de aminoacizi. Metoda Kjeldahl poate fi împărțită convenabil în trei etape: digestie, neutralizare și titrare.

Proba de hrană de analizat este cântărită într-un balon de digestie și apoi digerată prin încălzirea acesteia în prezența acidului sulfuric (un agent oxidant care digeră alimentele), a sulfatului de sodiu anhidru (pentru a accelera reacția prin creșterea punctului de fierbere) și un catalizator, cum ar fi cuprul, seleniul, titanul sau mercurul (pentru a accelera reacția). Digestia transformă orice azot din alimente (altul decât cel care este sub formă de nitrați sau nitriți) în amoniac și alte materii organice în C0 2 și H 2 0. Amoniacul gazos nu este eliberat într-o soluție acidă deoarece amoniacul este în forma ionului de amoniu (NH 4 + ) care se leagă de ionul sulfat (SO 4 2- ) și astfel rămâne în soluție:

După ce digestia a fost finalizată, balonul de digestie este conectat la un balon de primire printr-un tub. Soluția din balonul de digestie se face apoi alcalină prin adăugarea de hidroxid de sodiu, care transformă sulfatul de amoniu în amoniac gazos:

(NH 4 ) 2 SO 4 + 2 NaOH & reg 2NH 3 + 2H 2 O + Na 2 SO 4 (2)

Gazul de amoniac care se formează este eliberat din soluție și se deplasează din balonul de digestie în balonul receptor - care conține un exces de acid boric. pH-ul scăzut al soluției din balonul de recepție transformă gazul de amoniac în ionul de amoniu și, simultan, transformă acidul boric în ionul de borat:

NH 3 + H 3 BO 3 (acid boric) & reg NH 4 + + H 2 BO 3 - (ion borat) (3)

Conținutul de azot este apoi estimat prin titrarea boratului de amoniu format cu acid sulfuric sau clorhidric standard, folosind un indicator adecvat pentru a determina punctul final al reacției.

H 2 BO 3 - + H + ® H 3 BO 3 (4)

Concentrația ionilor de hidrogen (în moli) necesară pentru a ajunge la punctul final este echivalentă cu concentrația de azot care a fost în alimentul original (Ecuația 3). Următoarea ecuație poate fi utilizată pentru a determina concentrația de azot a unei probe care cântărește m grame folosind o soluție acidă x M HCl pentru titrare:

Unde vs și vb sunt volumele de titrare ale probei și ale martorului, iar 14 g este greutatea moleculară a azotului N. O probă martor este de obicei analizată în același timp cu materialul analizat pentru a lua în considerare orice azot rezidual care poate fi în reactivii folosiți pentru efectuarea analizei. Odată ce conținutul de azot a fost determinat, acesta este transformat într-un conținut de proteine ​​folosind factorul de conversie corespunzător: %Protein = F %N.

6.2.1.4. Avantaje și dezavantaje

Avantaje. Metoda Kjeldahl este utilizată pe scară largă la nivel internațional și este încă metoda standard de comparare cu toate celelalte metode. Universalitatea sa, precizia ridicată și reproductibilitatea bună au făcut din aceasta metoda principală de estimare a proteinelor din alimente.

Dezavantaje. Nu oferă o măsură a proteinei adevărate, deoarece tot azotul din alimente nu este sub formă de proteine. Diferite proteine ​​au nevoie de diferiți factori de corecție, deoarece au secvențe diferite de aminoacizi. Utilizarea acidului sulfuric concentrat la temperaturi ridicate prezintă un pericol considerabil, la fel ca și utilizarea unora dintre posibilii catalizatori. Realizarea tehnicii necesită mult timp.

6.2.2. Metoda Dumas îmbunătățită

Recent, a fost dezvoltată o tehnică instrumentală automată care este capabilă să măsoare rapid concentrația de proteine ​​din probele de alimente. Această tehnică se bazează pe o metodă descrisă pentru prima dată de un om de știință numit Dumas cu peste un secol și jumătate în urmă. Începe să concureze cu metoda Kjeldahl ca metodă standard de analiză a proteinelor pentru unele produse alimentare datorită rapidității sale.

O probă de masă cunoscută este arsă într-o cameră cu temperatură ridicată (aproximativ 900 o C) în prezența oxigenului. Aceasta conduce la eliberarea de CO 2 , H 2 O şi N 2 . CO 2 şi H 2 O sunt îndepărtate prin trecerea gazelor peste coloane speciale care le absorb. Conținutul de azot este apoi măsurat prin trecerea gazelor rămase printr-o coloană care are la capăt un detector de conductivitate termică. Coloana ajută la separarea azotului de orice CO2 și H2O rezidual care ar fi putut să fi rămas în fluxul de gaz. Instrumentul este calibrat prin analiza unui material care este pur și are o concentrație cunoscută de azot, cum ar fi EDTA (= 9,59%N). Astfel, semnalul de la detectorul de conductivitate termică poate fi convertit într-un conținut de azot. Ca și în cazul metodei Kjeldahl, este necesar să se transforme concentrația de azot dintr-o probă în conținutul de proteine, utilizând factori de conversie adecvați care depind de secvența precisă de aminoacizi a proteinei.

6.2.2.2. Avantaje și dezavantaje

Avantaje: Este mult mai rapidă decât metoda Kjeldahl (sub 4 minute pe măsurare, comparativ cu 1-2 ore pentru Kjeldahl). Nu are nevoie de substanțe chimice toxice sau catalizatori. Multe mostre pot fi măsurate automat. Este ușor de utilizat.

Dezavantaje: Cost inițial ridicat. Nu oferă o măsură a proteinei adevărate, deoarece tot azotul din alimente nu este sub formă de proteine. Diferite proteine ​​au nevoie de diferiți factori de corecție, deoarece au secvențe diferite de aminoacizi. Dimensiunea mică a eșantionului face dificilă obținerea unui eșantion reprezentativ.

6.2.3. Metode folosind spectroscopie UV-vizibil

Au fost concepute o serie de metode pentru a măsura concentrația de proteine, care se bazează pe spectroscopie UV-vizibil. Aceste metode folosesc fie capacitatea naturală a proteinelor de a absorbi (sau împrăștia) lumina în regiunea UV-vizibilă a spectrului electromagnetic, fie modifică chimic sau fizic proteinele pentru a le face să absoarbă (sau să împrăștie) lumina în această regiune. Principiul de bază din spatele fiecăruia dintre aceste teste este similar. În primul rând, se prepară o curbă de calibrare a absorbanței (sau turbidității) față de concentrația de proteine ​​folosind o serie de soluții de proteine ​​de concentrație cunoscută. Absorbanța (sau turbiditatea) soluției analizate este apoi măsurată la aceeași lungime de undă și concentrația sa de proteine ​​determinată din curba de calibrare. Principala diferență dintre teste sunt grupurile chimice care sunt responsabile pentru absorbția sau împrăștierea radiațiilor, de exemplu, legături peptidice, grupuri secundare aromatice, grupuri bazice și proteine ​​agregate.

Un număr dintre cele mai frecvent utilizate metode UV-vizibile pentru determinarea conținutului de proteine ​​din alimente sunt evidențiate mai jos:

Măsurare directă la 280 nm

Triptofanul și tirozina absorb puternic lumina ultravioletă la 280 nm. Conținutul de triptofan și tirozină al multor proteine ​​rămâne destul de constant, astfel încât absorbanța soluțiilor de proteine ​​la 280 nm poate fi utilizată pentru a determina concentrația acestora. Avantajele acestei metode sunt că procedura este simplă de efectuat, este nedistructivă și nu sunt necesari reactivi speciali. Dezavantajul major este că acizii nucleici absorb, de asemenea, puternic la 280 nm și, prin urmare, ar putea interfera cu măsurarea proteinei dacă sunt prezenți în concentrații suficiente. Chiar și așa, au fost dezvoltate metode pentru a depăși această problemă, de exemplu, prin măsurarea absorbanței la două lungimi de undă diferite.

O culoare violet-violet este produsă atunci când ionii cuprici (Cu 2+ ) interacționează cu legăturile peptidice în condiții alcaline. Reactivul biuret, care conține toate substanțele chimice necesare efectuării analizei, poate fi achiziționat din comerț. Se amestecă cu o soluție de proteine ​​și apoi se lasă să stea timp de 15-30 de minute înainte ca absorbanța să fie citită la 540 nm. Avantajul major al acestei tehnici este că nu există interferențe din partea materialelor care se adsorb la lungimi de undă mai mici, iar tehnica este mai puțin sensibilă la tipul de proteină, deoarece utilizează absorbția care implică legături peptidice care sunt comune tuturor proteinelor, mai degrabă decât grupurile laterale specifice. Cu toate acestea, are o sensibilitate relativ scăzută în comparație cu alte metode UV-vizibile.

Metoda Lowry combină reactivul biuret cu un alt reactiv (reactivul fenol Folin-Ciocalteau) care reacţionează cu reziduurile de tirozină şi triptofan din proteine. Acest lucru dă o culoare albăstruie care poate fi citită undeva între 500 - 750 nm, în funcție de sensibilitatea necesară. Există un vârf mic de aproximativ 500 nm care poate fi utilizat pentru a determina concentrații mari de proteine ​​și un vârf mare de aproximativ 750 nm care poate fi utilizat pentru a determina concentrații scăzute de proteine. Această metodă este mai sensibilă la concentrații scăzute de proteine ​​decât metoda biuretului.

Un exces cunoscut de colorant încărcat negativ (anionic) este adăugat la o soluție de proteine ​​al cărei pH este ajustat astfel încât proteinele să fie încărcate pozitiv (adică mai mult de punctul izoelectric). Proteinele formează un complex insolubil cu colorantul din cauza atracției electrostatice dintre molecule, dar colorantul nelegat rămâne solubil. Colorantul anionic se leagă la grupările cationice ale resturilor de aminoacizi bazici (histidină, arganină și lizină) și la grupările amino terminale libere.Cantitatea de colorant nelegat care rămâne în soluție după ce complexul proteină-colorant insolubil a fost îndepărtat (de exemplu, prin centrifugare) este determinată prin măsurarea absorbanței acestuia. Cantitatea de proteină prezentă în soluția originală este proporțională cu cantitatea de colorant care s-a legat de aceasta: colorant legat = colorant inițial - colorant liber.

Moleculele de proteine ​​care sunt în mod normal solubile în soluție pot fi făcute să precipite prin adăugarea anumitor substanțe chimice, de exemplu, acidul tricloracetic. Precipitarea proteinelor face ca soluția să devină tulbure. Astfel concentrația de proteine ​​poate fi determinată prin măsurarea gradului de turbiditate.

6.2.3.2. Avantaje și dezavantaje

Avantaje: Tehnicile UV-vizibile sunt destul de rapide și simplu de realizat și sunt sensibile la concentrații scăzute de proteine.

Dezavantaje: Pentru majoritatea tehnicilor UV-vizibile este necesar să se utilizeze soluții diluate și transparente, care nu conțin substanțe contaminante care absorb sau împrăștie lumina la aceeași lungime de undă cu proteina analizată. Nevoia de soluții transparente înseamnă că majoritatea alimentelor trebuie să sufere cantități semnificative de pregătire a probei înainte de a putea fi analizate, de exemplu, omogenizare, extracție cu solvent, centrifugare, filtrare, ceea ce poate fi consumator de timp și laborios. În plus, uneori este dificil să se extragă cantitativ proteine ​​din anumite tipuri de alimente, mai ales după ce acestea au fost procesate astfel încât proteinele să devină agregate sau legate covalent cu alte substanțe. În plus, absorbanța depinde de tipul de proteină analizată (diferitele proteine ​​au secvențe diferite de aminoacizi).

6.2.4. Alte tehnici instrumentale

Există o mare varietate de metode instrumentale diferite disponibile pentru determinarea conținutului total de proteine ​​din materialele alimentare. Acestea pot fi împărțite în trei categorii diferite în funcție de principiile lor fizico-chimice: (i) măsurarea proprietăților fizice în vrac, (ii) măsurarea adsorbției radiațiilor și (iii) măsurarea împrăștierii radiației. Fiecare metodă instrumentală are propriile sale avantaje și dezavantaje, precum și gama de alimente la care poate fi aplicată.

Măsurarea proprietăților fizice în vrac

  • Densitatea: densitatea unei proteine ​​este mai mare decât cea a majorității celorlalte componente ale alimentelor și astfel există o creștere a densității unui aliment pe măsură ce crește conținutul de proteine. Astfel, conținutul de proteine ​​al alimentelor poate fi determinat prin măsurarea densității acestora.
  • Indicele de refracție: indicele de refracție al unei soluții apoase crește pe măsură ce crește concentrația de proteine ​​și, prin urmare, măsurătorile RI pot fi utilizate pentru a determina conținutul de proteine.

Măsurarea absorbției radiațiilor

  • UV-vizibil: concentrația de proteine ​​poate fi determinată prin măsurarea absorbanței radiațiilor ultraviolete-vizibile (vezi mai sus).
  • Infraroșu: Tehnicile cu infraroșu pot fi utilizate pentru a determina concentrația proteinelor din probele alimentare. Proteinele absorb IR în mod natural datorită vibrațiilor caracteristice (întindere și îndoire) ale anumitor grupări chimice de-a lungul coloanei vertebrale polipeptidice. Măsurătorile absorbanței radiațiilor la anumite lungimi de undă pot fi astfel utilizate pentru a cuantifica concentrația de proteine ​​din probă. IR este deosebit de util pentru analiza rapidă on-line a conținutului de proteine. De asemenea, necesită puțină pregătire a probei și este nedistructivă. Dezavantajele sale majore sunt costul inițial ridicat și necesitatea unei calibrări extinse.
  • Rezonanța magnetică nucleară: Spectroscopia RMN poate fi utilizată pentru a determina concentrația totală de proteine ​​din alimente. Conținutul de proteine ​​este determinat prin măsurarea zonei de sub un vârf într-un spectre de deplasare chimică RMN care corespunde fracției de proteine.

Măsurarea împrăștierii radiațiilor

  • Difuzarea luminii: Concentrația agregatelor proteice în soluție apoasă poate fi determinată folosind tehnici de împrăștiere a luminii deoarece turbiditatea unei soluții este direct proporțională cu concentrația de agregate prezente.
  • Imprăștirea cu ultrasunete: Concentrația agregatelor de proteine ​​poate fi determinată și folosind tehnici de împrăștiere cu ultrasunete, deoarece viteza ultrasunetelor și absorbția ultrasunetelor sunt legate de concentrația agregatelor de proteine ​​prezente.

6.2.4.2. Avantaje și dezavantaje

Un număr dintre aceste metode instrumentale au avantaje majore față de celelalte tehnici menționate mai sus, deoarece sunt nedistructive, necesită puțină sau deloc pregătirea probei, iar măsurătorile sunt rapide și precise. Un dezavantaj major al tehnicilor care se bazează pe măsurători ale proprietăților fizice în vrac ale alimentelor este că trebuie pregătită o curbă de calibrare între proprietatea fizică de interes și conținutul total de proteine, iar acest lucru poate depinde de tipul de proteină prezent și de aliment. matricea în care este cuprinsă. În plus, tehnicile bazate pe măsurători ale proprietăților fizico-chimice în vrac pot fi utilizate doar pentru analizarea alimentelor cu compoziții relativ simple. Într-un aliment care conține multe componente diferite a căror concentrație poate varia, este dificil să se desprindă contribuția pe care o aduce proteina la măsurarea globală de cea a celorlalte componente.

6.2.5. Compararea metodelor

În calitate de oameni de știință în domeniul alimentației, putem fi adesea într-o poziție în care trebuie să alegem o anumită tehnică pentru măsurarea concentrației de proteine ​​a unui aliment. Cum decidem care tehnică este cea mai potrivită pentru aplicația noastră particulară? Primul lucru de stabilit este pentru ce vor fi folosite informațiile. Dacă analiza urmează să fie efectuată în scopuri oficiale, de exemplu, cerințe legale sau de etichetare, atunci este important să folosiți o metodă recunoscută oficial. Metoda Kjeldahl, și din ce în ce mai mult metoda Dumas, au fost aprobate oficial pentru o gamă largă de aplicații alimentare. În schimb, doar un număr mic de aplicații ale spectroscopiei UV-vizibile au fost recunoscute oficial.

În scopul controlului calității, este adesea mai util să existe măsurători rapide și simple ale conținutului de proteine ​​și, prin urmare, tehnicile IR sunt cele mai potrivite. Pentru studiile fundamentale în laborator, unde proteinele pure sunt adesea analizate, tehnicile spectroscopice UV-vizibile sunt adesea preferate deoarece oferă măsurători rapide și fiabile și sunt sensibile la concentrații scăzute de proteine.

Alți factori care ar putea trebui luați în considerare sunt cantitatea necesară de pregătire a probei, sensibilitatea și viteza lor. Metodele Kjeldahl, Dumas și IR necesită foarte puțină pregătire a probei. După ce a fost selectată o probă reprezentativă a alimentului, aceasta poate fi testată direct. Pe de altă parte, diferitele metode UV-vizibile necesită o pregătire extinsă a probei înainte de analiză. Proteina trebuie extrasă din alimente într-o soluție transparentă diluată, ceea ce implică, de obicei, proceduri de omogenizare, extracție cu solvent, filtrare și centrifugare consumatoare de timp. În plus, poate fi dificil să izolați complet unele proteine ​​din alimente, deoarece acestea sunt puternic legate de alte componente. Diferitele tehnici au, de asemenea, sensibilități diferite, adică cea mai mică concentrație de proteine ​​pe care o pot detecta. Metodele UV-vizibile sunt cele mai sensibile, fiind capabile să detecteze concentrații de proteine ​​de până la 0,001% în greutate. Sensibilitatea metodelor Dumas, Kjeldahl și IR este undeva în jur de 0,1% în greutate. Timpul necesar pentru analiză și numărul de probe care pot fi analizate simultan sunt, de asemenea, factori importanți de luat în considerare atunci când decideți ce tehnică analitică să utilizați. Tehnicile IR sunt capabile de analiză rapidă (< 1 minut) a concentrației de proteine ​​odată ce au fost calibrate. Metoda instrumentală modernă Dumas este complet automatizată și poate măsura concentrația proteică a unei probe în mai puțin de 5 minute, în comparație cu metoda Kjeldahl care durează între 30 de minute și 2 ore. Diferitele metode UV-vizibile variază între câteva minute și o oră (în funcție de tipul de colorant care este utilizat și de cât timp durează pentru a reacționa), deși are avantajul că multe probe pot fi rulate simultan. Cu toate acestea, este de obicei necesar să se efectueze o pregătire extinsă a probei înainte de analiză pentru a obține o soluție transparentă. Alți factori care pot fi importanți atunci când alegeți o tehnică adecvată sunt: ​​echipamentul disponibil, ușurința de operare, precizia dorită și dacă tehnica este sau nu nedistructivă.

6.3. Separarea și caracterizarea proteinelor

În prelegerea anterioară, au fost discutate tehnicile folosite pentru a determina concentrația totală de proteine ​​dintr-un aliment. Analiștii din alimente sunt adesea interesați și de tipul de proteine ​​prezente într-un aliment, deoarece fiecare proteină are proprietăți nutriționale și fizico-chimice unice. Tipul de proteină este de obicei determinat prin separarea și izolarea proteinelor individuale dintr-un amestec complex de proteine, astfel încât acestea să poată fi ulterior identificate și caracterizate. Proteinele sunt separate pe baza diferențelor în proprietățile lor fizico-chimice, cum ar fi dimensiunea, sarcina, caracteristicile de adsorbție, solubilitatea și stabilitatea termică. Alegerea unei tehnici de separare adecvate depinde de o serie de factori, inclusiv motivele pentru efectuarea analizei, cantitatea de probă disponibilă, puritatea dorită, echipamentul disponibil, tipul de proteine ​​prezente și costul. Sunt disponibile metode la scară largă pentru izolarea brută a cantităților mari de proteine, în timp ce metodele la scară mică sunt disponibile pentru proteinele care sunt scumpe sau disponibile doar în cantități mici. Unul dintre factorii care trebuie luați în considerare în timpul procedurii de separare este posibilitatea ca structura tridimensională nativă a moleculelor proteice să fie modificată.

O cunoaștere prealabilă a efectelor condițiilor de mediu asupra structurii și interacțiunilor proteinelor este extrem de utilă atunci când se selectează cea mai adecvată tehnică de separare. În primul rând, pentru că ajută la determinarea celor mai potrivite condiții de utilizat pentru a izola o anumită proteină dintr-un amestec de proteine ​​(de exemplu, pH, tărie ionică, solvent, temperatură etc.) și, în al doilea rând, pentru că poate fi important să alegeți condiții care vor nu afectează negativ structura moleculară a proteinelor.

6.3.1. Metode bazate pe diferite caracteristici de solubilitate

Proteinele pot fi separate prin exploatarea diferențelor în solubilitatea lor în soluții apoase. Solubilitatea unei molecule de proteină este determinată de secvența sa de aminoacizi, deoarece aceasta determină dimensiunea, forma, hidrofobia și sarcina electrică a acesteia. Proteinele pot fi precipitate sau solubilizate selectiv prin modificarea pH-ului, tăriei ionice, constantei dielectrice sau temperaturii unei soluții. Aceste tehnici de separare sunt cele mai simple de utilizat atunci când sunt implicate cantități mari de probă, deoarece sunt relativ rapide, ieftine și nu sunt influențate în mod deosebit de alte componente ale alimentelor. Ele sunt adesea folosite ca prim pas în orice procedură de separare, deoarece majoritatea materialelor contaminante pot fi îndepărtate cu ușurință.

Proteinele sunt precipitate din soluții apoase atunci când concentrația de sare depășește un nivel critic, care este cunoscut sub numele de sărare, deoarece toată apa este „legată” de săruri și, prin urmare, nu este disponibilă pentru hidratarea proteinelor. Sulfatul de amoniu [(NH4)2S04] este utilizat în mod obișnuit deoarece are o solubilitate ridicată în apă, deși pot fi utilizate și alte săruri neutre, de exemplu, NaCI sau KCI. În general, se utilizează o procedură în doi pași pentru a maximiza eficiența separării. În prima etapă, sarea este adăugată la o concentrație chiar sub cea necesară pentru a precipita proteina de interes. Soluția este apoi centrifugată pentru a îndepărta orice proteine ​​care sunt mai puțin solubile decât proteina de interes. Concentrația de sare este apoi crescută până la un punct chiar peste cel necesar pentru a provoca precipitarea proteinei. Aceasta precipită proteina de interes (care poate fi separată prin centrifugare), dar lasă proteine ​​mai solubile în soluție. Principala problemă cu această metodă este că concentrațiile mari de sare contaminează soluția, care trebuie îndepărtată înainte ca proteina să poată fi solubilizată, de exemplu, prin dializă sau ultrafiltrare.

Punctul izoelectric (pI) al unei proteine ​​este pH-ul în care sarcina netă a proteinei este zero. Proteinele tind să se agrega și să precipite la pI lor, deoarece nu există repulsie electrostatică care să le țină depărtate. Proteinele au puncte izoelectrice diferite din cauza secvențelor lor diferite de aminoacizi (adică, numărul relativ de grupări anionice și cationice) și astfel pot fi separate prin ajustarea pH-ului unei soluții. Când pH-ul este ajustat la pI al unei anumite proteine, acesta precipită, lăsând celelalte proteine ​​în soluție.

Solubilitatea unei proteine ​​depinde de constanta dielectrică a soluției care o înconjoară deoarece aceasta modifică amploarea interacțiunilor electrostatice dintre grupurile încărcate. Pe măsură ce constanta dielectrică a unei soluții scade, mărimea interacțiunilor electrostatice dintre speciile încărcate crește. Acest lucru tinde să scadă solubilitatea proteinelor în soluție deoarece acestea sunt mai puțin ionizate și, prin urmare, repulsia electrostatică dintre ele nu este suficientă pentru a preveni agregarea lor. Constanta dielectrică a soluțiilor apoase poate fi scăzută prin adăugarea de solvenți organici solubili în apă, cum ar fi etanol sau acetonă. Cantitatea de solvent organic necesară pentru a provoca precipitarea depinde de proteină și, prin urmare, proteinele pot fi separate pe această bază. Cantitatea optimă de solvent organic necesară pentru a precipita o proteină variază de la aproximativ 5 la 60%. Fracționarea solventului se realizează de obicei la 0 o C sau mai jos pentru a preveni denaturarea proteinelor cauzată de creșterile de temperatură care apar atunci când solvenții organici sunt amestecați cu apă.

Denaturarea proteinelor contaminante

Multe proteine ​​sunt denaturate și precipită din soluție atunci când sunt încălzite peste o anumită temperatură sau prin ajustarea unei soluții la pH-uri foarte acide sau bazice. Proteinele care sunt stabile la temperaturi ridicate sau la pH-uri extreme sunt cel mai ușor separate prin această tehnică, deoarece proteinele contaminante pot fi precipitate în timp ce proteina de interes rămâne în soluție.

6.3.2. Separarea datorită diferitelor caracteristici de adsorbție

Cromatografia de adsorbție implică separarea compușilor prin adsorbție-desorbție selectivă la o matrice solidă care este conținută într-o coloană prin care trece amestecul. Separarea se bazează pe diferitele afinități ale diferitelor proteine ​​pentru matricea solidă. Cromatografia de afinitate și de schimb ionic sunt cele două tipuri majore de cromatografia de adsorbție utilizate în mod obișnuit pentru separarea proteinelor. Separarea poate fi efectuată folosind fie o coloană deschisă, fie cromatografie lichidă de înaltă presiune.

Cromatografia cu schimb de ioni

Cromatografia cu schimb de ioni se bazează pe adsorbția-desorbția reversibilă a ionilor în soluție la o matrice solidă încărcată sau o rețea polimerică. Această tehnică este cea mai utilizată tehnică cromatografică pentru separarea proteinelor. O matrice încărcată pozitiv se numește schimbător de anioni deoarece leagă ionii încărcați negativ (anionii). O matrice încărcată negativ se numește schimbător de ioni pisica deoarece leagă ionii încărcați pozitiv (cationi). Condițiile tampon (pH și puterea ionică) sunt ajustate pentru a favoriza legarea maximă a proteinei de interes la coloana de schimb ionic. Proteinele contaminante se leagă mai puțin puternic și, prin urmare, trec mai rapid prin coloană. Proteina de interes este apoi eluată folosind o altă soluție tampon care favorizează desorbția acesteia din coloană (de exemplu, pH diferit sau tărie ionică).

Cromatografia de afinitate folosește o fază staționară care constă dintr-un ligand legat covalent la un suport solid. Ligandul este o moleculă care are o afinitate reversibilă foarte specifică și unică pentru o anumită proteină. Proba de analizat este trecută prin coloană și proteina de interes se leagă de ligand, în timp ce proteinele contaminante trec direct. Proteina de interes este apoi eluată folosind o soluție tampon care favorizează desorbția acesteia din coloană. Această tehnică este cea mai eficientă metodă de separare a unei proteine ​​individuale dintr-un amestec de proteine, dar este cea mai costisitoare, din cauza necesității de a avea coloane cu liganzi specifici legați de acestea.

Atât cromatografia de schimb de ioni, cât și cromatografia de afinitate sunt utilizate în mod obișnuit pentru a separa proteinele și aminoacizii în laborator. Ele sunt utilizate mai rar pentru separări comerciale deoarece nu sunt potrivite pentru separarea rapidă a volumelor mari și sunt relativ scumpe.

6.3.3. Separarea din cauza diferențelor de dimensiune

Proteinele pot fi, de asemenea, separate în funcție de dimensiunea lor. De obicei, greutățile moleculare ale proteinelor variază de la aproximativ 10.000 până la 1.000.000 de daltoni. În practică, separarea depinde de raza Stokes a unei proteine, mai degrabă decât direct de greutatea sa moleculară. Raza Stokes este raza medie pe care o are o proteină în soluție și depinde de structura sa moleculară tridimensională. Pentru proteinele cu aceeași greutate moleculară, raza Stokes crește în următoarea ordine: proteină globulară compactă < spirală flexibilă aleatorie < proteină asemănătoare tijei.

Dializa este utilizată pentru a separa moleculele în soluție prin utilizarea membranelor semipermeabile care permit trecerea moleculelor mai mici decât o anumită dimensiune, dar împiedică trecerea moleculelor mai mari. O soluție de proteine ​​este plasată într-un tub de dializă care este sigilat și plasat într-un volum mare de apă sau tampon care este agitat încet. Prin pungă curg substanțe dizolvate cu greutate moleculară mică, dar moleculele de proteine ​​cu greutate moleculară mare rămân în pungă. Dializa este o metodă relativ lentă, care durează până la 12 ore pentru a fi finalizată. Prin urmare, este cel mai frecvent utilizat în laborator. Dializa este adesea folosită pentru a îndepărta sarea din soluțiile de proteine ​​după ce acestea au fost separate prin sărare și pentru a schimba soluțiile tampon.

O soluție de proteină este plasată într-o celulă care conține o membrană semipermeabilă și se aplică presiune. Moleculele mai mici trec prin membrană, în timp ce moleculele mai mari rămân în soluție. Prin urmare, principiul de separare al acestei tehnici este similar cu dializa, dar, deoarece se aplică presiune, separarea este mult mai rapidă. Sunt disponibile membrane semipermeabile cu puncte de tăiere între aproximativ 500 și 300.000. Acea parte a soluției care este reținută de celulă (moleculele mari) se numește retentat, în timp ce partea care trece prin membrană (moleculele mici) face parte din ultrafiltrat. Ultrafiltrarea poate fi utilizată pentru concentrarea unei soluții de proteine, îndepărtarea sărurilor, schimbul de tampon sau fracționarea proteinelor în funcție de dimensiunea acestora. Unitățile de ultrafiltrare sunt utilizate în laborator și la scară comercială.

Cromatografia de excludere a mărimii

Această tehnică, uneori cunoscută sub numele de filtrare pe gel, separă și proteinele în funcție de dimensiunea lor. O soluție de proteină este turnată într-o coloană care este împachetată cu margele poroase dintr-un material polimeric reticulat (cum ar fi dextran sau agaroză).Moleculele mai mari decât porii din margele sunt excluse și se deplasează rapid prin coloană, în timp ce mișcarea moleculelor care intră în pori este întârziată. Astfel, moleculele sunt eluate din coloană în ordinea dimensiunii descrescătoare. Mărgele cu dimensiuni medii diferite ale porilor sunt disponibile pentru separarea proteinelor cu greutăți moleculare diferite. Producătorii acestor margele oferă informații despre intervalul de greutate moleculară pe care sunt cele mai potrivite pentru separare. Greutățile moleculare ale proteinelor necunoscute pot fi determinate comparând volumele lor de eluție Vo, cu cele determinate folosind proteine ​​cu greutate moleculară cunoscută: o diagramă a volumului de eluție versus log (greutatea moleculară) ar trebui să dea o linie dreaptă. O problemă cu această metodă este că greutatea moleculară nu este direct legată de raza Stokes pentru proteine ​​de diferite forme.

6.3.4. Separarea prin electroforeză

Electroforeza se bazează pe diferențele în migrarea moleculelor încărcate într-o soluție atunci când un câmp electric este aplicat peste ea. Poate fi folosit pentru a separa proteinele pe baza dimensiunii, formei sau încărcăturii lor.

În electroforeza nedenaturantă, o soluție tamponată de proteine ​​native este turnată pe un gel poros (de obicei poliacrilamidă, amidon sau agaroză) și se aplică o tensiune pe gel. Proteinele se deplasează prin gel într-o direcție care depinde de semnul încărcăturii lor și cu o rată care depinde de mărimea sarcinii și de frecarea mișcării lor:

Proteinele pot fi încărcate pozitiv sau negativ în soluție în funcție de punctele lor izoelectice (pI) și de pH-ul soluției. O proteină este încărcată negativ dacă pH-ul este peste pI și încărcată pozitiv dacă pH-ul este sub pI. Mărimea sarcinii și a tensiunii aplicate vor determina cât de departe migrează proteinele într-un anumit timp. Cu cât este mai mare tensiunea sau cu cât este mai mare sarcina proteinei, cu atât se va deplasa mai departe. Frecarea unei molecule este o măsură a rezistenței sale la mișcarea prin gel și este în mare măsură determinată de relația dintre dimensiunea efectivă a moleculei și dimensiunea porilor din gel. Cu cât dimensiunea moleculei este mai mică sau cu cât porii din gel sunt mai mari, cu atât rezistența este mai mică și, prin urmare, cu atât o moleculă se deplasează mai repede prin gel. Gelurile cu diferite porozități pot fi achiziționate de la furnizorii de produse chimice sau preparate în laborator. Dimensiuni mai mici ale porilor sunt obținute prin utilizarea unei concentrații mai mari de reactiv de reticulare pentru a forma gelul. Gelurile pot fi conținute între două plăci paralele sau în tuburi cilindrice. În electroforeza nedenaturantă, proteinele native sunt separate pe baza unei combinații a sarcinii, mărimii și formei lor.

În electroforeza de denaturare, proteinele sunt separate în primul rând în funcție de greutatea lor moleculară. Proteinele sunt denaturate înainte de analiză prin amestecarea lor cu mercaptoetanol, care descompune legăturile disulfurice, și dodecil sulfat de sodiu (SDS), care este un agent tensioactiv anionic care se leagă hidrofob de moleculele de proteine ​​și le determină să se desfășoare din cauza repulsiei dintre surfactantul încărcat negativ. cap-grupuri. Fiecare moleculă de proteină leagă aproximativ aceeași cantitate de SDS pe unitate de lungime. Prin urmare, sarcina pe unitate de lungime și conformația moleculară sunt aproximativ similare pentru toate proteinele. Pe măsură ce proteinele călătoresc printr-o rețea de gel, ele sunt separate în primul rând pe baza greutății lor moleculare, deoarece mișcarea lor depinde de dimensiunea moleculei proteice în raport cu dimensiunea porilor din gel: proteinele mai mici se deplasează mai rapid prin matrice decât cele mai mari. molecule. Acest tip de electroforeză este denumit în mod obișnuit electroforeză în gel de dodecil sulfat de sodiu-poliacrilamidă sau SDS-PAGE.

Pentru a determina cât de departe s-au deplasat proteinele, se adaugă un colorant de urmărire la soluția de proteine, de exemplu, albastru de bromofenol. Acest colorant este o moleculă mică încărcată care migrează înaintea proteinelor. După ce electroforeza este finalizată, proteinele sunt făcute vizibile prin tratarea gelului cu un colorant proteic, cum ar fi Coomassie Brilliant Blue sau colorant argintiu. Mobilitatea relativă a fiecărei benzi de proteine ​​este calculată:

Electroforeza este adesea folosită pentru a determina compoziția proteică a produselor alimentare. Proteina este extrasă din alimente în soluție, care este apoi separată prin electroforeză. SDS-PAGE este utilizat pentru a determina greutatea moleculară a unei proteine ​​prin măsurarea Rm și apoi comparând-o cu o curbă de calibrare produsă folosind proteine ​​cu greutate moleculară cunoscută: un grafic de log (greutate moleculară) în raport cu mobilitatea relativă este de obicei liniar. Electroforeza denaturantă este mai utilă pentru determinarea greutăților moleculare decât electroforeza nedenaturantă, deoarece frecarea la mișcare nu depinde de forma sau încărcarea inițială a moleculelor de proteine.

Electroforeza de focalizare izoelectrică

Această tehnică este o modificare a electroforezei, în care proteinele sunt separate prin sarcină pe o matrice de gel care are un gradient de pH peste ea. Proteinele migrează în locația în care pH-ul este egal cu punctul lor izoelectric și apoi se opresc din mișcare deoarece nu mai sunt încărcate. Această metodă are una dintre cele mai înalte rezoluții dintre toate tehnicile utilizate pentru separarea proteinelor. Sunt disponibile geluri care acoperă un interval îngust de pH (2-3 unități) sau un interval larg de pH (3-10 unități) și, prin urmare, ar trebui să alegeți un gel care este cel mai potrivit pentru proteinele care sunt separate.

Electroforeza bidimensională

Focalizarea izoelectrică și SDS-PAGE pot fi utilizate împreună pentru a îmbunătăți rezoluția amestecurilor complexe de proteine. Proteinele sunt separate într-o direcție pe baza sarcinii folosind focalizarea izoelectrică și apoi într-o direcție perpendiculară pe baza dimensiunii folosind SDS-PAGE.


Cuprins

Proteinele au fost recunoscute ca o clasă distinctă de molecule biologice în secolul al XVIII-lea de către Antoine Fourcroy și alții, remarcandu-se prin capacitatea moleculelor de a coagula sau de a flocula sub tratamente cu căldură sau acid. [1] Exemplele remarcate la acea vreme includeau albumina din albușul de ou, albumina serică din sânge, fibrina și glutenul de grâu.

Proteinele au fost descrise pentru prima dată de chimistul olandez Gerardus Johannes Mulder și numite de chimistul suedez Jöns Jacob Berzelius în 1838. [2] [3] Mulder a efectuat o analiză elementară a proteinelor comune și a descoperit că aproape toate proteinele aveau aceeași formulă empirică, C.400H620N100O120P1S1. [4] El a ajuns la concluzia eronată că ar putea fi compuse dintr-un singur tip de moleculă (foarte mare). Termenul „proteină” pentru a descrie aceste molecule a fost propus de asociatul lui Mulder. Proteina Berzelius este derivată din cuvântul grecesc πρώτειος (proteios), adică „primar”, [5] „în frunte”, sau „stă în fața”, [6] + -în. Mulder a continuat să identifice produsele de degradare a proteinelor, cum ar fi aminoacidul leucina pentru care a găsit o greutate moleculară (aproape corectă) de 131 Da. [4] Înainte de „proteină”, erau folosite alte denumiri, cum ar fi „albumine” sau „materiale albuminoase” (Eiweisskörper, in germana). [7]

Primii oameni de știință în nutriție, precum germanul Carl von Voit, credeau că proteinele sunt cel mai important nutrient pentru menținerea structurii organismului, deoarece se credea în general că „carnea face carne”. [8] Karl Heinrich Ritthausen a extins formele de proteine ​​cunoscute cu identificarea acidului glutamic. La Stația de experimente agricole din Connecticut, o revizuire detaliată a proteinelor vegetale a fost compilată de Thomas Burr Osborne. Lucrând cu Lafayette Mendel și aplicând legea lui Liebig a minimului în hrănirea șobolanilor de laborator, au fost stabiliți aminoacizii esențiali din punct de vedere nutrițional. Lucrarea a fost continuată și comunicată de William Cumming Rose. Înțelegerea proteinelor ca polipeptide a venit prin lucrările lui Franz Hofmeister și Hermann Emil Fischer în 1902. [9] [10] Rolul central al proteinelor ca enzime în organismele vii nu a fost pe deplin apreciat până în 1926, când James B. Sumner a arătat că enzima ureaza era de fapt o proteină. [11]

Dificultatea de a purifica proteinele în cantități mari le-a făcut foarte dificil de studiat pentru primii biochimiști ai proteinelor. Prin urmare, studiile timpurii s-au concentrat pe proteinele care ar putea fi purificate în cantități mari, de exemplu, cele din sânge, albuș de ou, diverse toxine și enzime digestive/metabolice obținute din abatoare. În anii 1950, Armor Hot Dog Co. a purificat 1 kg de ribonuclează A pancreatică pură bovină și a pus-o la dispoziția oamenilor de știință, acest gest a ajutat ribonucleaza A să devină o țintă majoră pentru studii biochimice în următoarele decenii. [4]

Linus Pauling este creditat cu predicția cu succes a structurilor secundare ale proteinelor obișnuite bazate pe legăturile de hidrogen, o idee prezentată pentru prima dată de William Astbury în 1933. [12] Lucrări ulterioare ale lui Walter Kauzmann privind denaturarea, [13] [14] bazate parțial pe anterioare. studiile lui Kaj Linderstrøm-Lang [15] au contribuit la înțelegerea plierii proteinelor și a structurii mediate de interacțiunile hidrofobe.

Prima proteină care a fost secvențializată a fost insulina, de Frederick Sanger, în 1949. Sanger a determinat corect secvența de aminoacizi a insulinei, demonstrând astfel în mod concludent că proteinele constau mai degrabă din polimeri liniari de aminoacizi decât din lanțuri ramificate, coloizi sau cicloli. [16] A câștigat Premiul Nobel pentru această realizare în 1958. [17]

Primele structuri proteice care au fost rezolvate au fost hemoglobina și mioglobina, de Max Perutz și, respectiv, Sir John Cowdery Kendrew, în 1958. [18] [19] Începând cu 2017 [actualizare] , Protein Data Bank are peste 126.060 de structuri cu rezoluție atomică. a proteinelor. [20] În vremuri mai recente, microscopia crio-electronică a ansamblurilor macromoleculare mari [21] și predicția computațională a structurii proteinelor din domeniile mici de proteine ​​[22] sunt două metode de abordare a rezoluției atomice.

Numărul de proteine ​​codificate într-un genom corespunde aproximativ numărului de gene (deși poate exista un număr semnificativ de gene care codifică ARN de proteine, de exemplu ARN-uri ribozomale). Virușii codifică de obicei câteva până la câteva sute de proteine, arheile și bacteriile câteva sute până la câteva mii, în timp ce eucariotele codifică de obicei câteva mii până la zeci de mii de proteine ​​(a se vedea dimensiunea genomului pentru o listă de exemple).

Majoritatea proteinelor constau din polimeri liniari construiți din serii de până la 20 diferiți L-α- aminoacizi. Toți aminoacizii proteinogeni posedă caracteristici structurale comune, inclusiv un carbon α de care sunt legate o grupare amino, o grupare carboxil și o catenă laterală variabilă. Doar prolina diferă de această structură de bază, deoarece conține un inel neobișnuit la gruparea amină de la capătul N, care forțează fragmentul amidă CO-NH într-o conformație fixă. [23] Lanțurile laterale ale aminoacizilor standard, detaliate în lista de aminoacizi standard, au o mare varietate de structuri și proprietăți chimice; este efectul combinat al tuturor lanțurilor laterale de aminoacizi dintr-o proteină care determină în cele din urmă sa structura tridimensională și reactivitatea sa chimică. [24] Aminoacizii dintr-un lanț polipeptidic sunt legați prin legături peptidice. Odată legat în lanțul proteic, un aminoacid individual se numește a reziduu, iar seria legată de atomi de carbon, azot și oxigen sunt cunoscute sub numele de lanțul principal sau coloana vertebrală proteică. [25] : 19

Legătura peptidică are două forme de rezonanță care contribuie la un caracter de dublă legătură și inhibă rotația în jurul axei sale, astfel încât carbonii alfa sunt aproximativ coplanari. Celelalte două unghiuri diedrice din legătura peptidică determină forma locală asumată de coloana vertebrală a proteinei. [25] : 31 Capătul cu o grupare amino liberă este cunoscut ca capătul N-terminal sau capătul amino terminal, în timp ce capătul proteinei cu o grupare carboxil liberă este cunoscut ca capătul C-terminal sau capătul carboxi terminal (secvența proteinei se scrie de la N-terminal la C-terminal, de la stânga la dreapta).

Cuvintele proteină, polipeptidă, și peptidă sunt puțin ambigue și se pot suprapune în sens. Proteină este în general folosit pentru a se referi la molecula biologică completă într-o conformație stabilă, în timp ce peptidă este în general rezervat pentru oligomeri de aminoacizi scurti, adesea lipsiți de o structură 3D stabilă. Dar granița dintre cele două nu este bine definită și se află de obicei aproape de 20-30 de reziduuri. [26] Polipeptidă se poate referi la orice lanț liniar unic de aminoacizi, de obicei indiferent de lungime, dar adesea implică absența unei conformații definite.

Interacțiuni

Abundență în celule

S-a estimat că bacteriile de dimensiuni medii conțin aproximativ 2 milioane de proteine ​​per celulă (de ex. E coli și Staphylococcus aureus). Bacteriile mai mici, cum ar fi Micoplasma sau spirochetele conțin mai puține molecule, de ordinul 50.000 până la 1 milion. În schimb, celulele eucariote sunt mai mari și, prin urmare, conțin mult mai multe proteine. De exemplu, s-a estimat că celulele de drojdie conțin aproximativ 50 de milioane de proteine ​​și celule umane de ordinul 1 până la 3 miliarde. [30] Concentrația de copii individuale de proteine ​​variază de la câteva molecule per celulă până la 20 de milioane. [31] Nu toate genele care codifică proteine ​​sunt exprimate în majoritatea celulelor și numărul lor depinde, de exemplu, de tipul celulei și de stimulii externi. De exemplu, din cele aproximativ 20.000 de proteine ​​codificate de genomul uman, doar 6.000 sunt detectate în celulele limfoblastoide. [32]

Biosinteza

Proteinele sunt asamblate din aminoacizi folosind informații codificate în gene. Fiecare proteină are propria sa secvență unică de aminoacizi, care este specificată de secvența de nucleotide a genei care codifică această proteină. Codul genetic este un set de seturi de trei nucleotide numite codoni și fiecare combinație de trei nucleotide desemnează un aminoacid, de exemplu AUG (adenină-uracil-guanină) este codul pentru metionină. Deoarece ADN-ul conține patru nucleotide, numărul total de codoni posibili este de 64, prin urmare, există o oarecare redundanță în codul genetic, cu unii aminoacizi specificați de mai mult de un codon. [29] : 1002–42 Genele codificate în ADN sunt mai întâi transcrise în ARN pre-mesager (ARNm) de proteine ​​precum ARN polimeraza. Cele mai multe organisme procesează apoi pre-ARNm (cunoscut și ca a transcrierea primară) folosind diferite forme de modificare post-transcripțională pentru a forma ARNm matur, care este apoi folosit ca șablon pentru sinteza proteinelor de către ribozom. La procariote, ARNm poate fi fie utilizat imediat ce este produs, fie legat de un ribozom după ce s-a îndepărtat de nucleoid. În schimb, eucariotele produc ARNm în nucleul celulei și apoi îl translocă prin membrana nucleară în citoplasmă, unde are loc apoi sinteza proteinelor. Rata de sinteză a proteinelor este mai mare la procariote decât la eucariote și poate ajunge până la 20 de aminoacizi pe secundă. [33]

Procesul de sinteză a unei proteine ​​dintr-un șablon de ARNm este cunoscut sub numele de traducere. ARNm este încărcat pe ribozom și este citit trei nucleotide la un moment dat prin potrivirea fiecărui codon cu anticodonul său de împerechere de baze situat pe o moleculă de ARN de transfer, care poartă aminoacidul corespunzător codonului pe care îl recunoaște. Enzima aminoacil tARN sintetaza „încarcă” moleculele de tARN cu aminoacizii corecti. Polipeptida în creștere este adesea numită lanț în curs de dezvoltare. Proteinele sunt întotdeauna biosintetizate de la capătul N-terminal la capătul C-terminal. [29] : 1002–42

Mărimea unei proteine ​​sintetizate poate fi măsurată prin numărul de aminoacizi pe care îi conține și prin masa sa moleculară totală, care este raportată în mod normal în unități de daltoni (sinonim cu unitățile de masă atomică) sau unitatea derivată kilodalton (kDa). Dimensiunea medie a unei proteine ​​crește de la Archaea la Bacterie la Eucariote (283, 311, 438 reziduuri și respectiv 31, 34, 49 kDa) datorită unui număr mai mare de domenii proteice care constituie proteine ​​în organismele superioare. [34] De exemplu, proteinele de drojdie au în medie 466 de aminoacizi lungime și 53 kDa în masă. [26] Cele mai mari proteine ​​cunoscute sunt titinele, o componentă a sarcomerului muscular, cu o masă moleculară de aproape 3.000 kDa și o lungime totală de aproape 27.000 de aminoacizi. [35]

Sinteză chimică

Proteinele scurte pot fi, de asemenea, sintetizate chimic printr-o familie de metode cunoscute sub numele de sinteza de peptide, care se bazează pe tehnici de sinteză organică, cum ar fi ligatura chimică, pentru a produce peptide cu randament ridicat. [36] Sinteza chimică permite introducerea de aminoacizi nenaturali în lanțurile polipeptidice, cum ar fi atașarea sondelor fluorescente la lanțurile laterale de aminoacizi. [37] Aceste metode sunt utile în biochimia de laborator și biologia celulară, deși, în general, nu pentru aplicații comerciale. Sinteza chimică este ineficientă pentru polipeptidele mai lungi de aproximativ 300 de aminoacizi, iar proteinele sintetizate pot să nu-și asume cu ușurință structura terțiară nativă. Majoritatea metodelor de sinteză chimică procedează de la capătul C-terminal la capătul N-terminal, opus reacției biologice. [38]

Majoritatea proteinelor se pliază în structuri 3D unice. Forma în care o proteină se pliază în mod natural este cunoscută ca conformația sa nativă. [25] : 36 Deși multe proteine ​​se pot plia neasistate, pur și simplu prin proprietățile chimice ale aminoacizilor lor, altele necesită ajutorul chaperonelor moleculare pentru a se plia în stările lor native. [25] : 37 Biochimiștii se referă adesea la patru aspecte distincte ale structurii unei proteine: [25] : 30–34

  • Structura primară: secvența de aminoacizi. O proteină este o poliamidă.
  • Structura secundară: structuri locale care se repetă în mod regulat stabilizate prin legături de hidrogen. Cele mai comune exemple sunt α-helix, β-sheet și spire. Deoarece structurile secundare sunt locale, multe regiuni cu structuri secundare diferite pot fi prezente în aceeași moleculă de proteină.
  • Structura terțiară: forma generală a unei singure molecule de proteină relația spațială a structurilor secundare între ele. Structura terțiară este în general stabilizată prin interacțiuni nelocale, cel mai frecvent formarea unui miez hidrofob, dar și prin punți de sare, legături de hidrogen, legături disulfură și chiar modificări post-translaționale. Termenul „structură terțiară” este adesea folosit ca sinonim cu termenul pliază. Structura terțiară este cea care controlează funcția de bază a proteinei.
  • Structura cuaternară: structura formată din mai multe molecule proteice (lanțuri polipeptidice), numite de obicei subunități proteice în acest context, care funcționează ca un singur complex proteic.
  • Structura quinară: semnăturile suprafeței proteice care organizează interiorul celular aglomerat. Structura quinară depinde de interacțiuni macromoleculare tranzitorii, dar esențiale, care apar în interiorul celulelor vii.

Proteinele nu sunt molecule complet rigide. În plus față de aceste niveluri de structură, proteinele se pot schimba între mai multe structuri înrudite în timp ce își îndeplinesc funcțiile. În contextul acestor rearanjamente funcționale, aceste structuri terțiare sau cuaternare sunt de obicei denumite „conformații”, iar tranzițiile dintre ele sunt numite modificări conformaționale. Astfel de modificări sunt adesea induse de legarea unei molecule de substrat la situsul activ al unei enzime sau regiunea fizică a proteinei care participă la cataliza chimică.În soluție, proteinele suferă, de asemenea, variații de structură prin vibrația termică și coliziunea cu alte molecule. [29] : 368–75

Proteinele pot fi împărțite informal în trei clase principale, care se corelează cu structurile terțiare tipice: proteine ​​globulare, proteine ​​fibroase și proteine ​​​​membranare. Aproape toate proteinele globulare sunt solubile și multe sunt enzime. Proteinele fibroase sunt adesea structurale, cum ar fi colagenul, componenta majoră a țesutului conjunctiv, sau cheratina, componenta proteică a părului și a unghiilor. Proteinele membranare servesc adesea ca receptori sau furnizează canale pentru ca moleculele polare sau încărcate să treacă prin membrana celulară. [29] : 165–85

Un caz special de legături de hidrogen intramoleculare în cadrul proteinelor, slab protejate de atacul apei și, prin urmare, promovând propria deshidratare, se numesc dehidroni. [39]

Domeniile proteice

Multe proteine ​​sunt compuse din mai multe domenii proteice, adică segmente ale unei proteine ​​care se pliază în unități structurale distincte. Domeniile au de obicei și funcții specifice, cum ar fi activități enzimatice (de exemplu kinaza) sau servesc ca module de legare (de exemplu, domeniul SH3 se leagă de secvențe bogate în prolină din alte proteine).

Motivul secvenței

Secvențele scurte de aminoacizi din proteine ​​acționează adesea ca locuri de recunoaștere pentru alte proteine. [40] De exemplu, domeniile SH3 se leagă de obicei la motive scurte PxxP (adică 2 proline [P], separate de doi aminoacizi nespecificați [x], deși aminoacizii din jur pot determina specificitatea exactă de legare). Multe astfel de motive au fost colectate în baza de date Eucariotic Linear Motif (ELM).

Proteinele sunt actorii principali din interiorul celulei, despre care se spune că îndeplinesc sarcinile specificate de informațiile codificate în gene. [26] Cu excepția anumitor tipuri de ARN, majoritatea celorlalte molecule biologice sunt elemente relativ inerte asupra cărora acționează proteinele. Proteinele reprezintă jumătate din greutatea uscată a unui Escherichia coli celula, în timp ce alte macromolecule, cum ar fi ADN-ul și ARN-ul reprezintă doar 3%, respectiv 20%. [41] Setul de proteine ​​exprimat într-o anumită celulă sau tip de celulă este cunoscut sub numele de proteomul său.

Caracteristica principală a proteinelor care permite, de asemenea, setul lor divers de funcții este capacitatea lor de a lega alte molecule în mod specific și strâns. Regiunea proteinei responsabilă de legarea unei alte molecule este cunoscută sub numele de situs de legare și este adesea o depresiune sau „buzunare” pe suprafața moleculară. Această capacitate de legare este mediată de structura terțiară a proteinei, care definește buzunarul locului de legare, și de proprietățile chimice ale lanțurilor laterale ale aminoacizilor din jur. Legarea proteinelor poate fi extraordinar de strânsă și specifică, de exemplu, proteina inhibitoare a ribonucleazei se leagă de angiogenina umană cu o constantă de disociere sub-femtomolară (<10 -15 M), dar nu se leagă deloc de onconaza sa omolog amfibian (>1 M). Modificări chimice extrem de minore, cum ar fi adăugarea unei singure grupări metil la un partener de legare, pot fi uneori suficiente pentru a elimina aproape legarea, de exemplu, aminoacil tARN sintetaza specifică aminoacidului valinei discriminează lanțul lateral foarte asemănător al izoleucinei aminoacidului. [42]

Proteinele se pot lega de alte proteine, precum și de substraturi cu molecule mici. Când proteinele se leagă în mod specific de alte copii ale aceleiași molecule, ele se pot oligomeriza pentru a forma fibrile, acest proces are loc adesea în proteinele structurale care constau din monomeri globulari care se auto-asociează pentru a forma fibre rigide. Interacțiunile proteină-proteină reglează, de asemenea, activitatea enzimatică, controlează progresia prin ciclul celular și permit asamblarea de complexe mari de proteine ​​care desfășoară multe reacții strâns legate cu o funcție biologică comună. Proteinele se pot lega și de membranele celulare sau chiar pot fi integrate în acestea. Capacitatea partenerilor de legare de a induce modificări conformaționale în proteine ​​permite construirea de rețele de semnalizare extrem de complexe. [29] : 830–49 Deoarece interacțiunile dintre proteine ​​sunt reversibile și depind în mare măsură de disponibilitatea diferitelor grupuri de proteine ​​partenere pentru a forma agregate care sunt capabile să îndeplinească seturi discrete de funcții, studiul interacțiunilor dintre proteine ​​​​specifice este o cheie. pentru a înțelege aspectele importante ale funcției celulare și, în cele din urmă, proprietățile care disting anumite tipuri de celule. [43] [44]

Enzime

Cel mai cunoscut rol al proteinelor în celulă este ca enzime, care catalizează reacțiile chimice. Enzimele sunt de obicei foarte specifice și accelerează doar una sau câteva reacții chimice. Enzimele efectuează majoritatea reacțiilor implicate în metabolism, precum și manipulează ADN-ul în procese precum replicarea ADN-ului, repararea ADN-ului și transcripția. Unele enzime acționează asupra altor proteine ​​pentru a adăuga sau elimina grupuri chimice într-un proces cunoscut sub numele de modificare post-translațională. Se știe că aproximativ 4.000 de reacții sunt catalizate de enzime. [45] Accelerarea vitezei conferită de cataliza enzimatică este adesea enormă - o creștere de până la 10 17 ori a vitezei față de reacția necatalizată în cazul orotat decarboxilazei (78 de milioane de ani fără enzimă, 18 milisecunde cu enzimă). [46]

Moleculele legate și asupra cărora acționează enzimele se numesc substraturi. Deși enzimele pot consta din sute de aminoacizi, de obicei, doar o mică parte a reziduurilor intră în contact cu substratul și o fracțiune și mai mică - trei până la patru reziduuri în medie - sunt direct implicate în cataliză. [47] Regiunea enzimei care leagă substratul și conține reziduurile catalitice este cunoscută ca situl activ.

Proteinele directe sunt membri ai unei clase de proteine ​​care dictează stereochimia unui compus sintetizat de alte enzime. [48]

Semnalizarea celulară și legarea ligandului

Multe proteine ​​sunt implicate în procesul de semnalizare celulară și de transducție a semnalului. Unele proteine, cum ar fi insulina, sunt proteine ​​extracelulare care transmit un semnal de la celula în care au fost sintetizate către alte celule din țesuturile îndepărtate. Altele sunt proteine ​​de membrană care acționează ca receptori a căror funcție principală este de a lega o moleculă de semnalizare și de a induce un răspuns biochimic în celulă. Mulți receptori au un situs de legare expus pe suprafața celulei și un domeniu efector în interiorul celulei, care poate avea activitate enzimatică sau poate suferi o modificare conformațională detectată de alte proteine ​​din interiorul celulei. [28] : 251–81

Anticorpii sunt componente proteice ale unui sistem imunitar adaptativ a căror funcție principală este de a lega antigenele sau substanțele străine din organism și de a le ținti spre distrugere. Anticorpii pot fi secretați în mediul extracelular sau ancorați în membranele celulelor B specializate cunoscute sub numele de celule plasmatice. În timp ce enzimele sunt limitate în afinitatea lor de legare pentru substraturile lor de necesitatea de a conduce reacția lor, anticorpii nu au astfel de constrângeri. Afinitatea de legare a unui anticorp la ținta sa este extraordinar de mare. [29] : 275–50

Multe proteine ​​de transport de liganzi leagă anumite biomolecule mici și le transportă în alte locații din corpul unui organism multicelular. Aceste proteine ​​trebuie să aibă o afinitate mare de legare atunci când ligandul lor este prezent în concentrații mari, dar trebuie să elibereze și ligandul atunci când este prezent la concentrații scăzute în țesuturile țintă. Exemplul canonic al unei proteine ​​de legare a ligandului este hemoglobina, care transportă oxigenul de la plămâni la alte organe și țesuturi la toate vertebratele și are omologi apropiați în fiecare regn biologic. [29] : 222–29 Lectinele sunt proteine ​​de legare a zahărului care sunt foarte specifice pentru fragmentele lor de zahăr. Lectinele joacă de obicei un rol în fenomenele de recunoaștere biologică care implică celule și proteine. [49] Receptorii și hormonii sunt proteine ​​de legare foarte specifice.

Proteinele transmembranare pot servi, de asemenea, ca proteine ​​de transport de ligand care modifică permeabilitatea membranei celulare la molecule mici și ioni. Membrana singură are un miez hidrofob prin care moleculele polare sau încărcate nu pot difuza. Proteinele membranei conțin canale interne care permit unor astfel de molecule să intre și să iasă din celulă. Multe proteine ​​ale canalelor ionice sunt specializate să selecteze doar un anumit ion, de exemplu, canalele de potasiu și sodiu discriminează adesea doar unul dintre cei doi ioni. [28] : 232–34

Proteine ​​structurale

Proteinele structurale conferă rigiditate și rigiditate componentelor biologice altfel fluide. Majoritatea proteinelor structurale sunt proteine ​​fibroase, de exemplu, colagenul și elastina sunt componente critice ale țesutului conjunctiv, cum ar fi cartilajul, iar keratina se găsește în structuri dure sau filamentoase, cum ar fi părul, unghiile, pene, copite și unele cochilii de animale. [29] : 178–81 Unele proteine ​​globulare pot juca, de asemenea, funcții structurale, de exemplu, actina și tubulina sunt globulare și solubile ca monomeri, dar polimerizează pentru a forma fibre lungi și rigide care alcătuiesc citoscheletul, ceea ce permite celulei să-și mențină. formă și dimensiune.

Alte proteine ​​care servesc funcții structurale sunt proteinele motorii, cum ar fi miozina, kinezina și dineina, care sunt capabile să genereze forțe mecanice. Aceste proteine ​​sunt cruciale pentru motilitatea celulară a organismelor unicelulare și spermatozoizii multor organisme multicelulare care se reproduc sexual. De asemenea, generează forțele exercitate de contractarea mușchilor [29] : 258–64, 272 și joacă roluri esențiale în transportul intracelular.

O întrebare cheie în biologia moleculară este cum evoluează proteinele, adică cum pot mutațiile (sau mai degrabă modificări ale secvenței de aminoacizi) să conducă la noi structuri și funcții? Majoritatea aminoacizilor dintr-o proteină pot fi modificați fără a perturba activitatea sau funcția, așa cum se poate observa din numeroase proteine ​​omoloage din specii (cum sunt colectate în baze de date specializate pentru familiile de proteine, de exemplu PFAM). [50] Pentru a preveni consecințele dramatice ale mutațiilor, o genă poate fi duplicată înainte de a putea muta liber. Cu toate acestea, acest lucru poate duce și la pierderea completă a funcției genelor și, prin urmare, a pseudogenelor. [51] Mai frecvent, modificările unui singur aminoacid au consecințe limitate, deși unele pot modifica substanțial funcția proteinelor, în special în enzime. De exemplu, multe enzime își pot modifica specificitatea substratului prin una sau câteva mutații. [52] Modificările specificității substratului sunt facilitate de promiscuitatea substratului, adică capacitatea multor enzime de a lega și procesa mai multe substraturi. Când apar mutații, specificitatea unei enzime poate crește (sau scădea) și, prin urmare, activitatea sa enzimatică. [52] Astfel, bacteriile (sau alte organisme) se pot adapta la diferite surse de hrană, inclusiv la substraturi nenaturale, cum ar fi plasticul. [53]

Activitățile și structurile proteinelor pot fi examinate in vitro, in vivo și in silico. In vitro studiile de proteine ​​purificate în medii controlate sunt utile pentru a afla cum o proteină își îndeplinește funcția: de exemplu, studiile cineticii enzimatice explorează mecanismul chimic al activității catalitice a unei enzime și afinitatea sa relativă pentru diferite molecule posibile de substrat. În contrast, in vivo experimentele pot oferi informații despre rolul fiziologic al unei proteine ​​în contextul unei celule sau chiar al unui întreg organism. In Silicon studiile folosesc metode computaționale pentru a studia proteinele.

Purificarea proteinelor

A efectua in vitro analiză, o proteină trebuie purificată departe de alte componente celulare. Acest proces începe de obicei cu liza celulară, în care membrana unei celule este perturbată și conținutul său intern eliberat într-o soluție cunoscută sub numele de lizat brut. Amestecul rezultat poate fi purificat folosind ultracentrifugarea, care fracţionează diferitele componente celulare în fracţii conţinând proteine ​​solubile, lipide membranare şi proteine, organele celulare şi acizi nucleici. Precipitarea printr-o metodă cunoscută sub numele de sărare poate concentra proteinele din acest lizat. Diferite tipuri de cromatografie sunt apoi utilizate pentru a izola proteina sau proteinele de interes pe baza proprietăților cum ar fi greutatea moleculară, sarcina netă și afinitatea de legare. [25] : 21–24 Nivelul de purificare poate fi monitorizat folosind diferite tipuri de electroforeză pe gel dacă se cunosc greutatea moleculară și punctul izoelectric al proteinei dorite, prin spectroscopie dacă proteina are caracteristici spectroscopice distinse sau prin teste enzimatice dacă proteina are activitate enzimatică. În plus, proteinele pot fi izolate în funcție de sarcina lor folosind electrofocalizarea. [54]

Pentru proteinele naturale, pot fi necesare o serie de etape de purificare pentru a obține proteine ​​suficient de pure pentru aplicații de laborator. Pentru a simplifica acest proces, ingineria genetică este adesea folosită pentru a adăuga caracteristici chimice proteinelor care le fac mai ușor de purificat fără a le afecta structura sau activitatea. Aici, o „etichetă” constând dintr-o secvență specifică de aminoacizi, adesea o serie de resturi de histidină (o „etichetă His”), este atașată la un capăt al proteinei. Ca rezultat, atunci când lizatul este trecut peste o coloană de cromatografie care conține nichel, reziduurile de histidină ligă nichelul și se atașează la coloană în timp ce componentele nemarcate ale lizatului trec nestingherite. Un număr de etichete diferite au fost dezvoltate pentru a ajuta cercetătorii să purifice proteine ​​specifice din amestecuri complexe. [55]

Localizare celulară

Studiul proteinelor in vivo este adesea preocupat de sinteza și localizarea proteinei în interiorul celulei. Deși multe proteine ​​intracelulare sunt sintetizate în citoplasmă și proteine ​​​​legate sau secretate de membrană în reticulul endoplasmatic, specificul modului în care proteinele sunt țintite către anumite organele sau structuri celulare este adesea neclar. O tehnică utilă pentru evaluarea localizării celulare utilizează ingineria genetică pentru a exprima într-o celulă o proteină de fuziune sau o himeră constând din proteina naturală de interes legată de un „reporter” cum ar fi proteina fluorescentă verde (GFP). [56] Poziția proteinei fuzionate în interiorul celulei poate fi vizualizată în mod curat și eficient folosind microscopie, [57] așa cum se arată în figura alăturată.

Alte metode pentru elucidarea locației celulare a proteinelor necesită utilizarea unor markeri compartimentali cunoscuți pentru regiuni precum ER, Golgi, lizozomi sau vacuole, mitocondrii, cloroplaste, membrana plasmatică etc. Cu utilizarea versiunilor marcate fluorescent ale acestor markeri sau de anticorpi la markeri cunoscuți, devine mult mai simplu să se identifice localizarea unei proteine ​​de interes. De exemplu, imunofluorescența indirectă va permite colocalizarea fluorescenței și demonstrarea locației. Coloranții fluorescenți sunt utilizați pentru a eticheta compartimentele celulare într-un scop similar. [58]

Există și alte posibilități. De exemplu, imunohistochimia utilizează de obicei un anticorp la una sau mai multe proteine ​​de interes care sunt conjugate cu enzime care produc semnale fie luminiscente, fie cromogene care pot fi comparate între probe, permițând informații de localizare. O altă tehnică aplicabilă este cofracționarea în gradienți de zaharoză (sau alt material) folosind centrifugarea izopicnică. [59] Deși această tehnică nu dovedește colocalizarea unui compartiment de densitate cunoscută și a proteinei de interes, crește probabilitatea și este mai susceptibilă de studii la scară largă.

În cele din urmă, metoda standard de aur de localizare celulară este microscopia imunoelectronică. Această tehnică folosește, de asemenea, un anticorp la proteina de interes, împreună cu tehnicile clasice de microscopie electronică. Proba este pregătită pentru examinarea microscopică electronică normală și apoi tratată cu un anticorp la proteina de interes care este conjugată cu un material extrem de electrodens, de obicei aur. Acest lucru permite localizarea atât a detaliilor ultrastructurale, cât și a proteinei de interes. [60]

Printr-o altă aplicație de inginerie genetică cunoscută sub numele de mutageneză direcționată pe site, cercetătorii pot modifica secvența proteinei și, prin urmare, structura acesteia, localizarea celulară și susceptibilitatea la reglare. Această tehnică permite chiar încorporarea aminoacizilor nenaturali în proteine, folosind tARN-uri modificate, [61] și poate permite proiectarea rațională de noi proteine ​​cu proprietăți noi. [62]

Proteomica

Complementul total de proteine ​​prezent la un moment dat într-o celulă sau tip de celulă este cunoscut sub numele de proteomul său, iar studiul unor astfel de seturi de date la scară largă definește domeniul proteomicii, denumit prin analogie cu domeniul înrudit al genomicii. Tehnicile experimentale cheie în proteomică includ electroforeza 2D, [63] care permite separarea multor proteine, spectrometria de masă, [64] care permite identificarea rapidă de mare debit a proteinelor și secvențierea peptidelor (cel mai adesea după digestia în gel), proteine. microarrays, care permit detectarea nivelurilor relative ale diferitelor proteine ​​prezente într-o celulă și screening-ul cu doi hibrizi, care permite explorarea sistematică a interacțiunilor proteină-proteină. [65] Complementul total de astfel de interacțiuni biologic posibile este cunoscut sub numele de interactom. [66] O încercare sistematică de a determina structurile proteinelor care reprezintă fiecare pliu posibil este cunoscută sub numele de genomica structurală. [67]

Determinarea structurii

Descoperirea structurii terțiare a unei proteine ​​sau a structurii cuaternare a complexelor sale poate oferi indicii importante despre modul în care proteina își îndeplinește funcția și cum poate fi afectată, adică în proiectarea medicamentelor. Deoarece proteinele sunt prea mici pentru a fi văzute la microscopul luminos, trebuie folosite alte metode pentru a le determina structura. Metodele experimentale comune includ cristalografia cu raze X și spectroscopia RMN, ambele putând produce informații structurale la rezoluție atomică. Cu toate acestea, experimentele RMN sunt capabile să ofere informații din care se poate estima un subset de distanțe între perechi de atomi, iar conformațiile finale posibile pentru o proteină sunt determinate prin rezolvarea unei probleme de geometrie a distanței. Interferometria cu polarizare dublă este o metodă analitică cantitativă pentru măsurarea conformației totale a proteinei și a modificărilor conformaționale datorate interacțiunilor sau altor stimuli. Dicroismul circular este o altă tehnică de laborator pentru determinarea compoziției interioare β-sheet/α-helical a proteinelor. Microscopia crioelectronică este utilizată pentru a produce informații structurale cu rezoluție mai mică despre complexe de proteine ​​foarte mari, inclusiv viruși asamblați [28] : 340–41 o variantă cunoscută sub numele de cristalografie electronică poate produce, de asemenea, informații de înaltă rezoluție în unele cazuri, în special pentru cristalele bidimensionale. a proteinelor membranare. [68] Structurile rezolvate sunt de obicei depozitate în Protein Data Bank (PDB), o resursă disponibilă gratuit din care se pot obține date structurale despre mii de proteine ​​sub formă de coordonate carteziene pentru fiecare atom din proteină. [69]

Sunt cunoscute mult mai multe secvențe de gene decât structurile proteinelor. În plus, setul de structuri rezolvate este orientat către proteine ​​care pot fi supuse cu ușurință condițiilor cerute în cristalografia cu raze X, una dintre metodele majore de determinare a structurii. În special, proteinele globulare sunt relativ ușor de cristalizat în pregătirea pentru cristalografia cu raze X.Proteinele membranare și complexele mari de proteine, prin contrast, sunt greu de cristalizat și sunt subreprezentate în PDB. [70] Inițiativele genomice structurale au încercat să remedieze aceste deficiențe prin rezolvarea sistematică a structurilor reprezentative ale claselor majore de pliuri. Metodele de predicție a structurii proteinelor încearcă să ofere un mijloc de generare a unei structuri plauzibile pentru proteine ​​ale căror structuri nu au fost determinate experimental. [71]

Predicția structurii

Complementar cu domeniul genomicii structurale, predicția structurii proteinelor dezvoltă modele matematice eficiente de proteine ​​pentru a prezice computațional formațiunile moleculare în teorie, în loc să detecteze structuri cu observație de laborator. [72] Cel mai de succes tip de predicție a structurii, cunoscut sub numele de modelare de omologie, se bazează pe existența unei structuri „șablon” cu asemănarea secvenței cu proteina care este modelată. Scopul genomicii structurale este de a oferi o reprezentare suficientă în structurile rezolvate pentru a modela majoritatea cele care rămân. [73] Deși producerea de modele precise rămâne o provocare atunci când sunt disponibile doar structuri de șablon înrudite la distanță, s-a sugerat că alinierea secvenței este blocajul în acest proces, deoarece pot fi produse modele destul de precise dacă se cunoaște o aliniere a secvenței „perfectă”. [74] Multe metode de predicție a structurii au servit la informarea domeniului emergent al ingineriei proteinelor, în care au fost deja proiectate noi pliuri proteice. [75] De asemenea, proteine ​​(la eucariote

33%) conțin segmente mari nestructurate, dar biologic funcționale și pot fi clasificate ca proteine ​​intrinsec dezordonate. [76] Predicția și analizarea tulburărilor proteice este, prin urmare, o parte importantă a caracterizării structurii proteinelor. [77]

Bioinformatica

O gamă largă de metode de calcul au fost dezvoltate pentru a analiza structura, funcția și evoluția proteinelor. Dezvoltarea unor astfel de instrumente a fost condusă de cantitatea mare de date genomice și proteomice disponibile pentru o varietate de organisme, inclusiv genomul uman. Este pur și simplu imposibil să se studieze toate proteinele în mod experimental, prin urmare doar câteva sunt supuse experimentelor de laborator, în timp ce instrumentele de calcul sunt folosite pentru a extrapola proteine ​​similare. Astfel de proteine ​​omoloage pot fi identificate eficient în organisme înrudite la distanță prin alinierea secvenței. Genomul și secvențele genelor pot fi căutate printr-o varietate de instrumente pentru anumite proprietăți. Instrumentele de profilare a secvenței pot găsi situsuri de enzime de restricție, cadre de citire deschise în secvențele de nucleotide și prezice structuri secundare. Arborii filogenetici pot fi construiți și ipotezele evolutive pot fi dezvoltate folosind un software special precum ClustalW cu privire la strămoșii organismelor moderne și genele pe care le exprimă. Domeniul bioinformaticii este acum indispensabil pentru analiza genelor și proteinelor.

Simularea in silico a proceselor dinamice

O problemă de calcul mai complexă este predicția interacțiunilor intermoleculare, cum ar fi în andocarea moleculară, [78] plierea proteinelor, interacțiunea proteină-proteină și reactivitatea chimică. Modelele matematice pentru a simula aceste procese dinamice implică mecanica moleculară, în special, dinamica moleculară. În această privință, in Silicon simulările au descoperit plierea unor domenii mici de proteine ​​α-helical, cum ar fi capul villin, [79] proteina accesorie HIV [80] și metode hibride care combină dinamica moleculară standard cu matematica mecanică cuantică au explorat stările electronice ale rodopsinelor. [81]

Dincolo de dinamica moleculară clasică, metodele de dinamică cuantică permit simularea proteinelor în detaliu atomistic cu o descriere precisă a efectelor mecanicii cuantice. Exemplele includ metoda Hartree cu mai multe straturi și configurații multiple dependente de timp (MCTDH) și abordarea ierarhică a ecuațiilor de mișcare (HEOM), care au fost aplicate criptocromilor de plante [82] și, respectiv, complexelor de recoltare a luminii bacteriilor [83]. Atât simulările mecanice cuantice, cât și cele clasice ale sistemelor la scară biologică sunt extrem de solicitante din punct de vedere computațional, astfel încât inițiativele de calcul distribuite (de exemplu, proiectul [email protected] [84] ) facilitează modelarea moleculară prin exploatarea progreselor în procesarea paralelă GPU și tehnici Monte Carlo.

Analiza chimica

Conținutul total de azot al materiei organice este format în principal din grupările amino din proteine. Azotul total Kjeldahl (TKN) este o măsură a azotului utilizată pe scară largă în analiza apei (resate), a solului, a alimentelor, a furajelor și a materiei organice în general. După cum sugerează și numele, se aplică metoda Kjeldahl. Sunt disponibile metode mai sensibile. [85] [86]

Majoritatea microorganismelor și plantelor pot biosintetiza toți cei 20 de aminoacizi standard, în timp ce animalele (inclusiv oamenii) trebuie să obțină o parte din aminoacizi din dietă. [41] Aminoacizii pe care un organism nu îi poate sintetiza singur sunt denumiți aminoacizi esențiali. Enzimele cheie care sintetizează anumiți aminoacizi nu sunt prezente la animale, cum ar fi aspartokinaza, care catalizează primul pas în sinteza lizinei, metioninei și treoninei din aspartat. Dacă aminoacizii sunt prezenți în mediul înconjurător, microorganismele pot conserva energia prin preluarea aminoacizilor din mediul înconjurător și reglarea în jos a căilor lor biosintetice.

La animale, aminoacizii se obțin prin consumul de alimente care conțin proteine. Proteinele ingerate sunt apoi descompuse în aminoacizi prin digestie, care implică de obicei denaturarea proteinei prin expunerea la acid și hidroliza de către enzime numite proteaze. Unii aminoacizi ingerați sunt utilizați pentru biosinteza proteinelor, în timp ce alții sunt transformați în glucoză prin gluconeogeneză sau introduși în ciclul acidului citric. Această utilizare a proteinelor ca combustibil este deosebit de importantă în condiții de foame, deoarece permite ca proteinele proprii ale corpului să fie folosite pentru a susține viața, în special cele găsite în mușchi. [87]

La animale precum câinii și pisicile, proteinele mențin sănătatea și calitatea pielii prin promovarea creșterii foliculilor de păr și a keratinizării și reducând astfel probabilitatea ca problemele pielii să producă mirosuri neplăcute. [88] Proteinele de proastă calitate au, de asemenea, un rol în ceea ce privește sănătatea gastrointestinală, crescând potențialul de flatulență și compuși mirositoare la câini, deoarece atunci când proteinele ajung în colon într-o stare nedigerată, sunt fermentate producând hidrogen sulfurat gazos, indol și skatol. [89] Câinii și pisicile digeră proteinele animale mai bine decât cele din plante, dar produsele de origine animală de calitate scăzută sunt prost digerate, inclusiv pielea, pene și țesutul conjunctiv. [89]


Purificarea și analiza proteinelor: tehnici de Western blotting de generație următoare

Western blotting este una dintre tehnicile cele mai frecvent utilizate în biologia moleculară și proteomică. Deoarece western blotting este un protocol în mai multe etape, pot apărea variații și erori la orice pas, reducând fiabilitatea și reproductibilitatea acestei tehnici. Rapoarte recente sugerează că câțiva pași cheie, cum ar fi metoda de preparare a probei, cantitatea și sursa de anticorp primar utilizat, precum și metoda de normalizare utilizată, sunt critice pentru rezultate reproductibile Western blot. Domenii acoperite: în această revizuire, sunt rezumate îmbunătățirile în diferite domenii ale Western blot, inclusiv transferul de proteine ​​și validarea anticorpilor. Revizuirea discută cele mai avansate tehnici de western blotting disponibile și evidențiază relația dintre tehnicile de western blotting de următoarea generație și relevanța sa clinică. Comentariu experților: În ultimul deceniu s-au făcut îmbunătățiri semnificative în crearea unor tehnici mai sensibile, automate și avansate prin optimizarea diferitelor aspecte ale protocolului Western blot. Au fost dezvoltate noi metode, cum ar fi Western blot cu rezoluție unică, electroforeza capilară, DigiWest, microfluid western blotting automat și electroforeza cu microcip pentru a reduce potențialele probleme asociate cu tehnica Western blotting. Evoluții inovatoare în instrumentare și sensibilitate crescută pentru Western blot oferă noi posibilități de creștere a implicațiilor clinice ale Western blot.

Cuvinte cheie: Immunoblot Western blotting Tehnici de Western blot de generație următoare Prepararea probelor de proteine ​​pentru purificarea proteinelor Western blot.


Etichetarea specifică locului a proteinelor cu ioni paramagnetici pentru determinarea structurilor proteinelor în soluție și în celule

Spectroscopia RMN de înaltă rezoluție este sensibilă la variațiile structurale locale și dinamica subtilă a biomoleculelor și este o tehnică importantă pentru studierea structurilor, dinamicii și interacțiunilor acestor molecule. Sonde cu molecule mici, inclusiv etichete paramagnetice, au fost dezvoltate în acest scop. Efectele paramagnetice manifestate în spectrele de rezonanță magnetică au fost de multă vreme recunoscute ca instrumente valoroase pentru analiza chimică a moleculelor mici, iar aceste efecte au fost ulterior aplicate în domeniile biologiei chimice și biologiei structurale. Cu toate acestea, astfel de aplicații necesită instalarea unui centru paramagnetic în biomoleculele de interes. Ionii metalici paramagnetici și radicalii liberi stabili sunt cele mai utilizate sonde paramagnetice pentru spectroscopia de rezonanță magnetică biologică și, prin urmare, abordările ușoare, cu randament ridicat pentru atașarea chimică a etichetelor paramagnetice la biomolecule sunt la mare căutare. În acest cont, începem prin a discuta speciile paramagnetice, în special ionii de metale tranziționale și ionii de lantanide, care sunt potrivite pentru studiile RMN și EPR, în special pentru aplicații în celule. După aceea, descriem abordări pentru etichetarea specifică site-ului a proteinelor cu ioni paramagnetici și discutăm considerentele implicate în proiectarea etichetelor paramagnetice de înaltă calitate, inclusiv puterea legăturii dintre fragmentul de chelare a metalelor și ionul paramagnetic, stabilitatea chimică și flexibilitatea legăturii dintre eticheta paramagnetică și proteina țintă. Flexibilitatea unei etichete se corelează puternic cu media efectelor paramagnetice observate în spectrele RMN și descriem metode pentru creșterea rigidității etichetei și aplicațiile unor astfel de etichete în sistemele biologice. De asemenea, descriem aplicații specifice ale abordărilor de etichetare specifice site-ului stabilite și etichetelor paramagnetice nou dezvoltate pentru elucidarea structurilor și dinamicii proteinelor la rezoluție atomică atât în ​​soluție, cât și în celule. În primul rând, descriem determinarea structurii 3D a unui complex intermediar de enzime de scurtă durată, cu abundență scăzută, în timp real, folosind schimbările de pseudocontact ca restricții structurale. În al doilea rând, demonstrăm utilitatea etichetelor paramagnetice stabile pentru determinarea structurilor 3D ale proteinelor în celulele vii, iar schimbările de pseudocontact se dovedesc a fi restricții structurale valoroase pentru analiza proteinelor în celule. În al treilea rând, arătăm că o etichetă paramagnetică optimizată RMN permite determinarea restricțiilor de distanță pe proteine ​​prin măsurători de rezonanță dublă electron-electron (DEER) cu rezoluție spațială mare atât in vitro, cât și în celule. În cele din urmă, rezumăm progresele recente în etichetarea specifică site-ului a proteinelor pentru a obține informații de rezoluție atomică despre modificările structurale ale proteinelor și avantajele și provocările spectroscopiei de rezonanță magnetică în sistemele biologice.


Al șaselea simț al delfinilor îi ajută să detecteze câmpurile electrice

Delfinii sunt creaturi absolut uimitoare, mai deștepți dincolo de orice ați putea crede și cu o inimă de aur. Dar acum, cercetătorii au arătat că, pe lângă aceste calități, delfinii comuni din Guyana au încă o abilitate remarcabilă: puterea de a simți câmpurile electrice.

Delfinul își poartă puiul la fel ca orice alt mamifer placentar, iar acest simț neobișnuit este probabil util atunci când pradă în apa tulbure de coastă unde trăiește.

„Majoritatea animalelor care fac asta fac asta pentru a găsi prada”, a spus cercetătorul Wolf Hanke, de la Universitatea Rostock din Rostock, Germania. “Toți prada delfinilor’, cum ar fi racii, toți generează câmpuri electrice într-o anumită măsură.”

Cercetătorii au analizat un delfin din Guyana care murise din cauze naturale la Dolphinariumin Münster, Germania. S-au concentrat pe pori specializați numiți cripte vibrisale, care sunt practic casa mustăților. Dar din moment ce delfinii au evoluat din mustăți, acum au doar porii rămași. Ei au descoperit că cei 2-10 pori sunt înconjurați de numeroase terminații nervoase și sunt, de asemenea, umpluți cu o matrice specială de proteine ​​și celule.

Pentru a vedea dacă un curent electric poate fi detectat în vreun fel de către delfini, oamenii de știință au testat acești pori, iar rezultatele au avut succes, ajungând la concluzia că până și 5 microvolți pe centimetru ar putea fi detectați practic, ei sunt suficient de sensibili pentru a detecta semnătura electrică. a unui peste.

Niciun alt mamifer nu a dezvoltat această abilitate cu adevărat extraordinară în afară de un ordin care depune ouă, numite monotreme, care includ ornitorincul. Cu toate acestea, este posibil să existe și alte animale cu această abilitate.

“Cred că este posibil, probabil, pentru că există niște delfini, precum botul de sticla, care au și mici gropi pe bot. Sunt mai mici, dar nu este puțin probabil ca și acesta sau alții să-l dezvolte, a spus Hanke.

Cu toate acestea, spre deosebire de majoritatea mamiferelor, delfinii au avut un motiv foarte întemeiat să evolueze în acest fel în apele tulburi în care trăiesc, vizibilitatea este adesea redusă drastic, astfel încât capacitatea de a simți electric alte animale ar putea face toată diferența.